Prvá časť (až po modrú čiaru) je v princípe úvodom do génovej terapie, aby sme lepšie porozumeli samotným metódam a aby sme sa aspoň trochu nenechali nachytať učiteľom. Ak nemáte čas a potrebujete KONKRÉTNY materiál k danej problematike, prejdite doprava za modrú čiaru.

Génová terapia bola pôvodne zameraná na liečbu monogénových dedičných chorôb, potom sa jej záber rozšíril a začalo sa o nej uvažovať ako o potenciálne univerzálnom prístupe k liečbe celého spektra chorôb, vrátane infekčných chorôb, rakoviny, aterosklerózy, cukrovky. a niekoľko ďalších.

"Génová liečba"- korekcia defektu v géne (monogénne ochorenia) - na úrovni somatických a zárodočných buniek - nahradenie mutantného génu normálnym.

"Génové liečenie"- korekcia defektu zavedením plnohodnotného pracovného génu (cDNA).

Najprv všeobecná teória:

Kritickou podmienkou pre úspešnú génovú terapiu je zabezpečenie účinného dodania, t.j. transfekcia (v širšom zmysle) resp transdukcia (pri použití vírusových vektorov) cudzieho génu do cieľových buniek, čím sa zabezpečí jeho dlhodobé fungovanie v týchto bunkách a vytvoria sa podmienky pre plnohodnotné fungovanie génu (jeho expresiu).

Stratégie na nápravu genetických defektov:

Podľa typu vektorového systému:

Vírusové

Výhody vírusových vektorov: transdukcia veľkého počtu buniek; tropizmus; odolnosť voči lyzozomálnej degradácii.

Nevýhody vírusových vektorov: imunogenicita (s fatálnymi následkami - adeno- a herpesvírusy); potenciálna karcinogenita (retrovírusy).

Nevírusové

Priama injekcia do bunky, tkaniva, orgánu (známa ako mikroinjekcia);

Lipofekcia (s pomocou rôznych modifikovaných lipozómov (lipidové vezikuly s DNA vo vnútri);

· Elektroporácia;

· Ako súčasť plazmidu;

Komplexná DNA (plazmidová DNA kombinovaná so soľami, proteínmi atď.);

· Génová pištoľ (DNA je pripojená k časticiam zlata vystreleným na tkanivo pacienta);

Endocytóza sprostredkovaná receptormi.

Výhody nevírusového doručenia: relatívna bezpečnosť; nedostatok imunitnej odpovede; jednoduchosť použitia.

Nevýhody nevírusového dodania: nízka účinnosť transfekcie; nízka úroveň prejavu.

Teoreticky najradikálnejším a najefektívnejším spôsobom je nahradenie defektného génu v zárodočných bunkách (fetálna génová terapia), existujú však etické problémy. V súčasnosti sú všetky prístupy génovej terapie založené na génovej terapii na úrovni somatických buniek.

Podľa mechanizmu účinku vloženého génu alebo prenesenej molekuly DNA sa génová terapia delí na pozitívnu (obnovenie funkcie génu (obnovením jeho práce alebo vložením novej pracovnej kópie) alebo negatívnu - potlačenie funkcia génu). Navyše existuje prístup zameraný na posilnenie imunitnej odpovede, ktorý sa využíva najmä v génovej terapii rakoviny (viac o tom nižšie).

Do ľudského tela môžu byť tiež zavedené nové génové informácie ako súčasť jeho vlastných predtransformovaných in vitro buniek. prístup ex vivo. Prístup, pri ktorom sa génová informácia zavádza priamo do buniek živého človeka, sa nazýva (náhle) in vivo, lokálne zavedenie do niektorých špecifických oblastí sa nazýva in situ. V súčasnosti existujú úspešné precedensy na zavedenie génovej informácie in utero (do embrya), v Spojenom kráľovstve sa najnovšie podarilo zachrániť dieťa pred mitochondriálnym ochorením.

Ďalšie prístupy génovej terapie:

· Antisense DNA, RNA (+): špecificita, môže byť použitá v akomkoľvek vektore, neimunogénnom; (-): rýchla degradácia v bunke);

Ribozýmy (+): majú vlastnosti enzýmov – nekonzumujú sa, sú schopné katalyzovať cieľové štiepenie, na rozdiel od proteínov nie sú imunogénne, indukujú syntézu interferónu; (-): rýchla degradácia;

transdominantné negatívne proteíny;

Jednoreťazcové protilátky

· Samovražedné gény (namiesto „liečby“ bunku možno jednoducho zabiť, používa sa v protirakovinových systémoch, (podrobnejšie budú nižšie);

Zavedenie antigén-špecifických lymfocytov;

Chimeroplastika (hybridy DNA/RNA s vlásenkovou štruktúrou, ktoré produkujú homológnu rekombináciu v jadre);

Uvádzame len príklady metód génovej terapie, pozri popisy chorôb v predchádzajúcich očíslovaných lístkoch.

Monogénne choroby:

Nedostatok adenozíndeaminázy(ADA syndróm) je prvým relatívne úspešným príkladom využitia génovej terapie. Bola vykonaná 14.9.1990. Tento dátum sa považuje za narodeniny skutočnej génovej terapie.

Pomocou leukoforézy boli mononukleárne bunky izolované z periférnej krvi, potom boli pestované v kultúre v podmienkach proliferácie T buniek. Potom sa retrovírusový vektor obsahujúci normálny gén ADA zaviedol do buniek proliferujúcich in vitro. O niekoľko dní neskôr boli transdukované krvinky injikované späť pacientovi. Proces sa opakoval 7-krát počas 10 mesiacov. Účinok bol pozitívny, ¼ lymfocytov v tele dostala funkčný gén. Raz za 3-5 mesiacov sa zavedenie modifikovaných buniek opakovalo. V súčasnosti sa vyvíja génová terapia tohto ochorenia v smere využitia kmeňových buniek pacienta. Tým sa výrazne zníži počet injekcií modifikovaných buniek v dôsledku ich viacnásobného delenia už v samotnom organizme a pri dosiahnutí selektívnej a kvantitatívnej výhody modifikovaných kmeňových buniek oproti natívnym sa vytvorí dostatočná hladina enzýmu v tele. .

Dedičná hypercholesterolémia - Je známe, že nedeliace sa hepatocyty nemôžu byť infikované retrovírusmi. Po hepatektómii sa hepatocyty začnú množiť a získavajú schopnosť infikovať sa retrovírusmi. Gén cDNA pre normálny LDL-R receptor sa zaviedol do hepatocytov získaných z pacientovej pečene pomocou retrovírusového vektora. Po reinfúzii rekombinantných hepatocytov cez portálnu žilu do pečene sa pozoroval pokles hladín lipoproteínov s nízkou hustotou (najmä cholesterolu) v krvi a pomer lipoproteínov s nízkou hustotou k lipoproteínom s vysokou hustotou. To znamená, že zavedené bunky fungovali in vivo a internalizovali a vymieňali cholesterol.

Hemofília B -Úspešné skúšky sa uskutočnili na psoch s použitím stratégie ex vivo s
dodanie cDNA kódujúcej faktor IX do hepatocytov. Bolo možné dosiahnuť syntézu faktora IX v množstvách tvoriacich 0,1 % normálneho množstva faktora IX v krvnej plazme. V snahe zvýšiť koncentráciu faktora IX boli použité adenovírusové vektory, ale účinok bol krátkodobý. Krv zvierat sa koagulovala, ale účinok po 2 mesiacoch úplne zmizol (typický nedostatok adenovírusových vektorov).

Hemofília A - Existujú správy o úspešnom zavedení skráteného génu faktora VIII do myší ako súčasti retrovírusového vektora. V dôsledku toho sa dosiahne terapeutická hladina faktora v krvi.

Cystická fibróza - Ukázalo sa, že nahradenie 6-10 % buniek pľúcneho epitelu transfekovanými bunkami obnoví normálne transportné funkcie transmembránových kanálov, ktoré zabezpečujú transport chloridových iónov. Retrovírusy nie sú vhodné, keďže neinfikujú nedeliace sa bunky, s výhradou sú vhodné adenovírusy, pretože pri pokusoch na myšiach vyvolávali zápalové reakcie. Problém navyše spočíva v glykokalyxovej bariére na povrchu bunky. Jedným prístupom na vyriešenie tohto problému je modifikácia vektora, ktorý obsahuje špecifický ligand pre receptor na povrchu pľúcnych epitelových buniek. Interakcia ligandu s receptorom zvyčajne vedie k internalizácii vektora spolu s receptorom do bunky. Ako taký receptor bol vybraný transmembránový receptor P2Y2-R. Tento receptor sa podieľa na spúšťaní kaskády zápalových reakcií v pľúcnej dutine. Ako ligand sa použili buď monoklonálne protilátky proti tomuto receptoru alebo prirodzený ligand, biotinUTP.

Duchennova svalová dystrofia - Choroba sa začína prejavovať v detstve a súčasne by sa mala vykonávať génová terapia. Najsľubnejšie je použitie adenovírusových vektorov. Vzhľadom na veľkú dĺžku génu výskumníci používajú skrátené, ale funkčné kópie proteínu. Experimenty na myších modeloch, ktoré majú defektný dystrofínový gén, ukázali, že 5 až 50 % svalových buniek exprimuje skrátený dystrofínový proteín. To stačilo na minimalizáciu svalovej degenerácie. Existujú údaje o klinických skúškach genetického konštruktu nesúceho gén pre dystrofín na liečbu pacientov s Duchennovou svalovou dystrofiou. Choré deti po injekcii do svalov tohto dizajnu získali schopnosť pohybu. Účinok bol však krátkodobý.

Multifaktoriálne ochorenia na príklade onkologických ochorení:

Rakovina je zvyčajne výsledkom viacstupňových zmien buniek. Zložitosť spojená so zapojením mnohých génov a ich produktov do nádorového procesu vyvolala pochybnosti o účinnosti génovej terapie rakoviny. Existuje však množstvo experimentov, ktoré ukazujú, že kompenzácia jedného supresorového génu môže viesť k potlačeniu nádorových vlastností buniek.

Imunoterapia rakoviny:

Použitie konštruktov génovej terapie, ktoré stimulujú imunitnú (hlavne bunkovú) protinádorovú odpoveď. Na vytvorenie génových konštruktov sa používajú gény: Antigény (na ktorých funguje imunitný systém); komplex MHCI (hlavný komplex histokompatibility); faktor B7; cytokíny; T bunkové receptory. Potlačenie vývoja nádoru je možné dosiahnuť klonovaním génov cytokínov: interleukíny IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, ako aj tumor nekrotizujúci faktor-α (TNF-α), interferóny (INF-α, INF-ϒ)

Potlačenie rastu rakovinových buniek zavedením génov, ktorých produkty inhibujú vývoj nádoru:

Nádorové supresorové gény (RB, P53, mdm2, Cip 1, P16, cyklín D)

samovražedné gény

inhibítory onkogénov.

Antiangiogenézne faktory

inhibítory cyklínu

Gény, ktoré zvyšujú citlivosť nádorových buniek na liečivé zlúčeniny

Gény prenášačov liečiv (zavedenie napríklad do buniek kostnej drene)

Veľký význam pri supresii onkogénov má gén p53 (zodpovedný za apoptózu a je schopný zastaviť bunkový cyklus, bráni nekontrolovanému deleniu), takže jeho mutácia takmer vždy vedie k malígnej transformácii bunky. Adenovírusové vektory sa používajú na zavedenie pracovnej kópie génu p53 do tela. Po spustení expresie génu p53 v jadre rakovinovej bunky indukuje jej apoptózu.

Ďalší prístup je potlačenie onkogénov. Mutácia v géne RAS môže viesť ku konštitutívnej operácii signalizačného systému spúšťajúceho delenie (MAP kinázová kaskáda, pamätajte Nikolaichik J). Na blokovanie tohto génu je možné 1) inhibovať expresiu RAS zavedením intaktného génu; 2) inhibícia RAS ribozýmami; 3) inhibícia základných génov v signálnej dráhe; 4) zabránenie inkorporácii proteínu RAS do membrány.

Použitie onkolytických vírusov. Vírusová onkolýza je zásadne nový prístup k liečbe onkologických ochorení, založený na prirodzenej schopnosti vírusov zabíjať (lyzovať) bunky, v ktorých sa množia. Na to sa používajú reovírusy, poliovírusy, echovírusy a vírusy Coxsackie + niektoré modifikované adenovírusy, ktoré sa množia najmä v nádorových bunkách a vedú ich k apoptóze. REOLYSIN, vyrábaný spoločnosťou Oncolytic Biotech, v súčasnosti prechádza klinickými skúškami. Adenovírusy exprimujúce antiangiogénne proteíny sa považujú za veľmi sľubné.

Úvod

Každý rok sa vo vedeckých časopisoch objavuje čoraz viac článkov o lekárskych klinických štúdiách, v ktorých sa tak či onak používala liečba založená na zavádzaní rôznych génov – génová terapia. Tento smer vyrástol z tak dobre rozvinutých odvetví biológie, ako je molekulárna genetika a biotechnológia.

Často, keď už boli vyskúšané konvenčné (konzervatívne) metódy, je to práve génová terapia, ktorá môže pacientom pomôcť prežiť a dokonca sa úplne zotaviť. Týka sa to napríklad dedičných monogénnych chorôb, teda chorôb spôsobených defektom jedného génu, ako aj mnohých iných. Alebo napríklad génová terapia môže pomôcť a zachrániť končatinu tým pacientom, ktorí majú zúžený lúmen ciev dolných končatín a v dôsledku toho sa vyvinula pretrvávajúca ischémia okolitých tkanív, to znamená, že tieto tkanivá zažívajú závažný nedostatok živín a kyslíka, ktoré sú normálne prenášané krvou cez telo. Často je nemožné liečiť takýchto pacientov chirurgickými manipuláciami a liekmi, ale ak sú bunky lokálne nútené vylučovať viac proteínových faktorov, ktoré by ovplyvnili proces tvorby a klíčenia nových ciev, potom by sa ischémia stala oveľa menej výraznou a stala by sa pre pacientov oveľa jednoduchšie žiť.

génová terapia dnes možno definovať ako liečbu chorôb zavádzaním génov do buniek pacientov s cieľom zamerať sa na génové defekty alebo dať bunkám nové funkcie. Prvé klinické skúšky metód génovej terapie sa uskutočnili až 22. mája 1989 s cieľom diagnostikovať rakovinu. Prvým dedičným ochorením, pri ktorom sa aplikovali metódy génovej terapie, bola dedičná imunodeficiencia.

Každoročne narastá počet úspešne vykonaných klinických štúdií na liečbu rôznych ochorení pomocou génovej terapie a do januára 2014 dosiahol 2 tis.

V modernom výskume génovej terapie je zároveň potrebné vziať do úvahy, že dôsledky manipulácie s génmi či „premiešanej“ (rekombinantnej) DNA in vivo(lat. doslova „živý“) neboli dostatočne prebádané. V krajinách s najpokročilejšou úrovňou výskumu v tejto oblasti, najmä v USA, lekárske protokoly využívajúce sekvencie sense DNA podliehajú povinnému skúmaniu v príslušných výboroch a komisiách. V USA sú to Poradný výbor pre rekombinantnú DNA (RAC) a Food and Drug Administration (FDA) s následným povinným schválením projektu riaditeľom National Institutes of Health (National Institutes of Health).

Rozhodli sme sa teda, že táto liečba je založená na skutočnosti, že ak niektorým tkanivám tela chýbajú niektoré individuálne proteínové faktory, potom sa to dá napraviť zavedením vhodných génov kódujúcich proteíny do týchto tkanív a všetko bude viac-menej úžasné. . Samotné bielkoviny nie je možné aplikovať injekčne, pretože naše telo okamžite zareaguje neslabou imunitnou odpoveďou a dĺžka pôsobenia by bola nedostatočná. Teraz sa musíme rozhodnúť o spôsobe dodania génu do buniek.

Transfekcia bunky

Na začiatok je vhodné uviesť definície niektorých pojmov.

Prenos génov sa uskutočňuje pomocou vektor je molekula DNA používaná ako „nosič“ na umelý prenos genetickej informácie do bunky. Existuje mnoho typov vektorov: plazmidové, vírusové, ako aj kozmidy, fazmidy, umelé chromozómy atď. Je zásadne dôležité, aby vektory (najmä plazmidové vektory) mali svoje charakteristické vlastnosti:

1. Pôvod replikácie (ori)- nukleotidová sekvencia, v ktorej začína duplikácia DNA. Ak sa nepodarí zdvojiť (replikovať) vektorovú DNA, potom sa nedosiahne potrebný terapeutický efekt, pretože sa jednoducho rýchlo rozštiepi intracelulárnymi nukleázovými enzýmami a v dôsledku nedostatku templátov sa nakoniec vytvorí oveľa menej molekúl proteínov. Treba si uvedomiť, že tieto body sú špecifické pre každý biologický druh, teda ak sa predpokladá, že vektorová DNA sa získa jej rozmnožovaním v bakteriálnej kultúre (a nie len chemickou syntézou, ktorá je zvyčajne oveľa drahšia), potom dva body začiatku replikácie budú potrebné oddelene - pre ľudí a pre baktérie;

2. Reštrikčné stránky- špecifické krátke sekvencie (zvyčajne palindromické), ktoré sú rozpoznávané špeciálnymi enzýmami (reštrikčné endonukleázy) a sú nimi určitým spôsobom strihané - s tvorbou "lepivých koncov" (obr. 1).

Obr.1 Tvorba "lepivých koncov" za účasti restriktáz

Tieto miesta sú potrebné na zosieťovanie vektorovej DNA (ktorá je v skutočnosti "prázdna") s požadovanými terapeutickými génmi do jedinej molekuly. Takáto molekula zosieťovaná z dvoch alebo viacerých častí sa nazýva "rekombinantná";

3. Je jasné, že by sme chceli získať milióny kópií molekuly rekombinantnej DNA. Opäť, ak máme čo do činenia s kultúrou bakteriálnych buniek, tak táto DNA musí byť ďalej izolovaná. Problém je v tom, že nie všetky baktérie prehltnú molekulu, ktorú potrebujeme, niektoré nie. Aby sa tieto dve skupiny rozlíšili, sú vložené do vektorovej DNA selektívne markery- oblasti odolnosti voči určitým chemikáliám; Teraz, ak sa tieto isté látky pridajú do životného prostredia, prežijú iba tie, ktoré sú voči nim odolné, a zvyšok zomrie.

Všetky tieto tri zložky možno pozorovať v úplne prvom umelo syntetizovanom plazmide (obr. 2).

Obr.2

Samotný proces zavádzania plazmidového vektora do určitých buniek je tzv transfekcia. Plazmid je pomerne krátka a zvyčajne kruhová molekula DNA, ktorá sa nachádza v cytoplazme bakteriálnej bunky. Plazmidy nie sú spojené s bakteriálnym chromozómom, môžu sa replikovať nezávisle od neho, môžu byť baktériou uvoľňované do prostredia alebo naopak absorbované (proces absorpcie je transformácia). Pomocou plazmidov si baktérie môžu vymieňať genetické informácie, napríklad prenášať rezistenciu na niektoré antibiotiká.

Plazmidy existujú v baktériách in vivo. Ale nikto nemôže zabrániť výskumníkovi, aby umelo syntetizoval plazmid, ktorý bude mať vlastnosti, ktoré potrebuje, všil doň inzertný gén a zaviedol ho do bunky. Do rovnakého plazmidu môžu byť vložené rôzne inzerty .

Metódy génovej terapie

Existujú dva hlavné prístupy, ktoré sa líšia povahou cieľových buniek:

1. fetálny, pri ktorom je cudzia DNA zavedená do zygoty (oplodneného vajíčka) alebo embrya v ranom štádiu vývoja; v tomto prípade sa očakáva, že zavedený materiál vstúpi do všetkých buniek príjemcu (a dokonca aj do zárodočných buniek, čím sa zabezpečí prenos do ďalšej generácie). U nás je to vlastne zakázané;

2. Somatické, pri ktorých sa genetický materiál vnáša do nepohlavných buniek už narodených a neprenáša sa do zárodočných buniek.

Génová terapia in vivo je založená na priamom zavedení klonovaných (namnožených) a špecificky zabalených sekvencií DNA do určitých tkanív pacienta. Obzvlášť sľubné na liečbu génových ochorení in vivo je zavedenie génov pomocou aerosólových alebo injekčných vakcín. Aerosólová génová terapia sa spravidla vyvíja na liečbu pľúcnych ochorení (cystická fibróza, rakovina pľúc).

Vývoju programu génovej terapie predchádza mnoho etáp. Ide o dôkladnú analýzu tkanivovo špecifickej expresie zodpovedajúceho génu (t. j. syntézu na génovej matrici nejakého proteínu v určitom tkanive) a identifikáciu primárneho biochemického defektu a štúdium štruktúry, funkcie a intracelulárnu distribúciu svojho proteínového produktu, ako aj biochemickú analýzu patologického procesu. Všetky tieto údaje sa berú do úvahy pri zostavovaní príslušného lekárskeho protokolu.

Je dôležité, aby pri zostavovaní schém na korekciu génov bola účinnosť transfekcie, stupeň korekcie primárneho biochemického defektu v podmienkach bunkovej kultúry ( in vitro,"in vitro") a čo je najdôležitejšie, in vivo na zvieracích biologických modeloch. Až potom môže začať program klinického skúšania. .

Priame dodávanie a bunkové nosiče terapeutických génov

Existuje mnoho metód na zavedenie cudzej DNA do eukaryotickej bunky: niektoré závisia od fyzikálneho spracovania (elektroporácia, magnetofekcia atď.), iné od použitia chemických materiálov alebo biologických častíc (napr. vírusy), ktoré sa používajú ako nosiče. Hneď stojí za zmienku, že chemické a fyzikálne metódy sa zvyčajne kombinujú (napríklad elektroporácia + obalenie DNA lipozómami)

Priame metódy

1. Chemickú transfekciu možno rozdeliť do niekoľkých typov: pomocou cyklodextrínovej látky, polymérov, lipozómov alebo nanočastíc (s chemickou alebo vírusovou funkcionalizáciou, t. j. povrchovou modifikáciou alebo bez nej).
a) Jednou z najlacnejších metód je použitie fosforečnanu vápenatého. Zvyšuje účinnosť inkorporácie DNA do buniek 10-100 krát. DNA tvorí s vápnikom silný komplex, ktorý zabezpečuje jeho efektívne vstrebávanie. Nevýhodou je, že do jadra sa dostane len asi 1 - 10 % DNA. Použitá metóda in vitro na prenos DNA do ľudských buniek (obr. 3);

Obr.3

b) Využitie vysoko rozvetvených organických molekúl – dendriméru, na naviazanie DNA a jej prenos do bunky (obr. 4);

Obr.4

c) Veľmi účinnou metódou transfekcie DNA je jej zavedenie prostredníctvom lipozómov – malých, membránou obklopených teliesok, ktoré sa môžu spojiť s bunkovou cytoplazmatickou membránou (CPM), čo je dvojitá vrstva lipidov. Pre eukaryotické bunky je transfekcia účinnejšia s katiónovými lipozómami, pretože bunky sú na ne citlivejšie. Proces má svoj vlastný názov - lipofekcia. Táto metóda je dnes považovaná za jednu z najbezpečnejších. Lipozómy sú netoxické a neimunogénne. Účinnosť prenosu génov pomocou lipozómov je však obmedzená, pretože nimi zavedená DNA do buniek je zvyčajne okamžite zachytená lyzozómami a zničená. Vnášanie DNA do ľudských buniek pomocou lipozómov je dnes základom terapie. in vivo(obr. 5);

Obr.5

d) Ďalším spôsobom je použitie katiónových polymérov, ako je dietylaminoetyl-dextrán alebo polyetylénimín. Negatívne nabité molekuly DNA sa viažu na pozitívne nabité polykatióny a tento komplex sa potom dostáva do bunky endocytózou. DEAE-dextrán mení fyzikálne vlastnosti plazmatickej membrány a stimuluje príjem tohto komplexu bunkou. Hlavnou nevýhodou metódy je, že DEAE-dextrán je vo vysokých koncentráciách toxický. Metóda nebola rozšírená v génovej terapii;

e) Pomocou histónov a iných jadrových proteínov. Tieto proteíny, obsahujúce veľa kladne nabitých aminokyselín (Lys, Arg), v prirodzených podmienkach pomáhajú kompaktne zbaliť dlhý reťazec DNA do relatívne malého bunkového jadra.

2. Fyzikálne metódy:

a) Elektroporácia je veľmi populárna metóda; Okamžité zvýšenie priepustnosti membrány sa dosiahne vďaka skutočnosti, že bunky sú vystavené krátkemu vystaveniu intenzívnemu elektrickému poľu. Ukázalo sa, že za optimálnych podmienok môže počet transformantov dosiahnuť 80 % prežívajúcich buniek. V súčasnosti sa na ľuďoch nepoužíva (obr. 6).

Obr.6

b) „Stláčanie buniek“ – metóda vynájdená v roku 2013. Umožňuje dodávať molekuly bunkám „mäkkým stláčaním“ bunkovej membrány. Metóda eliminuje možnosť toxicity alebo nesprávneho zásahu do cieľa, pretože nezávisí od vonkajších materiálov alebo elektrických polí;

c) Sonoporácia - metóda umelého prenosu cudzej DNA do buniek ich vystavením ultrazvuku, čo spôsobí otvorenie pórov v bunkovej membráne;
d) Optická transfekcia – metóda, pri ktorej sa v membráne vytvorí malý otvor (priemer približne 1 µm) pomocou vysoko zaostreného lasera;
e) Hydrodynamická transfekcia – metóda na dodávanie genetických konštruktov, proteínov atď. riadeným zvýšením tlaku v kapilárach a intersticiálnej tekutine, čo spôsobuje krátkodobé zvýšenie priepustnosti bunkových membrán a tvorbu dočasných pórov v nich. Vykonáva sa rýchlou injekciou do tkaniva, pričom podávanie je nešpecifické. Účinnosť podávania pre kostrové svalstvo – 22 až 60 % ;

f) DNA mikroinjekcia - zavedenie do jadra živočíšnych buniek pomocou tenkých sklenených mikrotubulov (d=0,1-0,5 µm). Nevýhodou je zložitosť metódy, pravdepodobnosť deštrukcie jadra alebo DNA je vysoká; môže byť transformovaný obmedzený počet buniek. Nepoužíva sa pre ľudí.

3. Metódy založené na časticiach.

a) Priamym prístupom k transfekcii je génová pištoľ, v ktorej sa DNA spája do nanočastice s inertnými pevnými látkami (zvyčajne zlatom, volfrámom), ktoré potom „vystrelia“ nasmerované na jadrá cieľových buniek. Táto metóda sa aplikuje in vitro a in vivo na zavedenie génov, najmä do buniek svalových tkanív, napríklad pri chorobe, ako je Duchennova svalová dystrofia. Veľkosť častíc zlata je 1-3 mikróny (obr. 7).

Obr.7

b) Magnetofekcia – metóda, ktorá využíva sily magnetizmu na dodanie DNA do cieľových buniek. Najprv sú nukleové kyseliny (NA) spojené s magnetickými nanočasticami a potom sú častice pôsobením magnetického poľa vháňané do bunky. Účinnosť je takmer 100%, je zaznamenaná zjavná netoxicita. Už po 10-15 minútach sú častice zaregistrované v bunke - je to oveľa rýchlejšie ako iné metódy.
c) Napichovanie (napichovanie; „napichovanie“, dosl. „napichovanie“ + „infekcia“) – spôsob dodávania využívajúci nanomateriály, ako sú uhlíkové nanorúrky a nanovlákna. V tomto prípade sú bunky doslova prepichnuté podložkou z nanofibríl. Predpona „nano“ sa používa na označenie ich veľmi malých rozmerov (v miliardtinách metra) (obr. 8).

Obr.8

Samostatne stojí za to zdôrazniť takú metódu, ako je transfekcia RNA: do bunky sa nedodáva DNA, ale molekuly RNA - ich „nástupcovia“ v reťazci biosyntézy proteínov; súčasne sa aktivujú špeciálne proteíny, ktoré štiepia RNA na krátke fragmenty – tzv. malá interferujúca RNA (siRNA). Tieto fragmenty sa viažu na iné proteíny a v konečnom dôsledku to vedie k inhibícii expresie zodpovedajúcich génov bunkou. Je teda možné zablokovať pôsobenie tých génov v bunke, ktoré v súčasnosti potenciálne spôsobujú viac škody ako úžitku. Transfekcia RNA našla široké uplatnenie najmä v onkológii.

Uvažuje sa o základných princípoch prenosu génov pomocou plazmidových vektorov. Teraz môžeme prejsť k úvahám o vírusových metódach. Vírusy sú nebunkové formy života, najčastejšie ide o molekulu nukleovej kyseliny (DNA alebo RNA) obalenú proteínovým obalom. Ak z genetického materiálu vírusu vystrihneme všetky tie sekvencie, ktoré spôsobujú výskyt chorôb, potom sa dá celý vírus úspešne zmeniť aj na „vozidlo“ pre náš gén.

Proces zavádzania DNA do bunky, sprostredkovaný vírusom, sa nazýva tzv transdukcia.
V praxi sa najčastejšie používajú retrovírusy, adenovírusy a adeno-asociované vírusy (AAV). Na začiatok stojí za to zistiť, čo by malo byť ideálnym kandidátom na transdukciu medzi vírusmi. Kritériá sú, že musí byť:

stabilný;
. kapacita, to znamená, že obsahuje dostatočné množstvo DNA;
. inertný vo vzťahu k metabolickým dráham bunky;
. presný – ideálne by mal integrovať svoj genóm do špecifického lokusu genómu jadra hostiteľa atď.

V reálnom živote je veľmi ťažké skombinovať aspoň niekoľko bodov, takže väčšinou k voľbe dochádza pri posudzovaní každého jednotlivého prípadu samostatne (obr. 9).

Obr.9

Z uvedených troch najpoužívanejších vírusov je AAV najbezpečnejší a zároveň najpresnejší. Takmer jedinou ich nevýhodou je relatívne malá kapacita (okolo 4800 bp), ktorá sa však ukazuje ako dostatočná pre mnohé gény. .

Okrem vyššie uvedených metód sa génová terapia často používa v kombinácii s bunkovou terapiou: najprv sa kultúra určitých ľudských buniek zasadí do živného média, potom sa potrebné gény tak či onak zavedú do buniek, kultivujú sa a znova sa transplantovali do hostiteľského organizmu. Výsledkom je, že bunky sa môžu vrátiť k svojim normálnym vlastnostiam. Takže napríklad ľudské biele krvinky (leukocyty) boli modifikované pri leukémii (obr. 10).

Obr.10

Osud génu po vstupe do bunky

Keďže s vírusovými vektormi je vďaka ich schopnosti efektívnejšie dopravovať gény do konečného cieľa – jadra, všetko viac-menej jasné, pozastavíme sa nad osudom plazmidového vektora.

V tomto štádiu sme dosiahli, že DNA prešla prvou veľkou bariérou – cytoplazmatickou membránou bunky.

Ďalej, v kombinácii s inými látkami, s obalom alebo bez obalu, sa musí dostať do bunkového jadra, aby špeciálny enzým - RNA polymeráza - syntetizoval molekulu messenger RNA (mRNA) na šablóne DNA (tento proces sa nazýva prepis). Až potom mRNA vstúpi do cytoplazmy, vytvorí komplex s ribozómami a podľa genetického kódu sa syntetizuje polypeptid - napríklad vaskulárny rastový faktor (VEGF), ktorý začne vykonávať určitú terapeutickú funkciu ( v tomto prípade naštartuje proces tvorby cievneho vetvenia v tkanive náchylnom na ischémiu) .

Čo sa týka expresie zavedených génov v požadovanom bunkovom type, tento problém sa rieši pomocou transkripčných regulačných prvkov. Tkanivo, v ktorom dochádza k expresii, je často určené kombináciou tkanivovo špecifického zosilňovača ("posilňovacia" sekvencia) so špecifickým promótorom (nukleotidová sekvencia, z ktorej RNA polymeráza začína syntézu), ktorý môže byť indukovateľný. . Je známe, že génová aktivita môže byť modulovaná in vivo vonkajšie signály, a keďže zosilňovače môžu pracovať s akýmkoľvek génom, do vektorov sa môžu zaviesť aj izolátory, ktoré pomáhajú zosilňovaču pracovať bez ohľadu na jeho polohu a môžu sa správať ako funkčné bariéry medzi génmi. Každý zosilňovač obsahuje súbor väzbových miest na aktiváciu alebo potlačenie proteínových faktorov. Promótory môžu tiež regulovať hladinu génovej expresie. Napríklad existujú metalotioneín alebo promótory citlivé na teplotu; hormónmi riadené promótory.

Expresia génu závisí od jeho polohy v genóme. Vo väčšine prípadov existujúce vírusové metódy vedú iba k náhodnému vloženiu génu do genómu. Aby sa eliminovala takáto závislosť, pri konštrukcii vektorov je gén vybavený známymi nukleotidovými sekvenciami, ktoré umožňujú expresiu génu bez ohľadu na miesto jeho inzercie do genómu.

Najjednoduchším spôsobom regulácie expresie transgénu je poskytnúť mu indikátorový promótor, ktorý je citlivý na fyziologický signál, ako je uvoľňovanie glukózy alebo hypoxia. Takéto "endogénne" kontrolné systémy môžu byť užitočné v niektorých situáciách, ako je kontrola produkcie inzulínu závislá od glukózy. Spoľahlivejšie a všestrannejšie sú „exogénne“ kontrolné systémy, keď je expresia génov riadená farmakologicky zavedením malej molekuly liečiva. V súčasnosti sú známe 4 hlavné kontrolné systémy – regulované tetracyklínom (Tet), hmyzím steroidom, ekdyzónom alebo jeho analógmi, antiprogestínovým liekom maifpriston (RU486) a chemickými dimerizátormi, ako je rapamycín a jeho analógy. Všetky zahŕňajú nábor transkripčnej aktivačnej domény do hlavného promótora, ktorý vedie požadovaný gén, závislý od liečiva, ale líšia sa v mechanizmoch tohto náboru. .

Záver

Preskúmanie údajov vedie k záveru, že napriek úsiliu mnohých laboratórií vo svete sú všetky už známe a testované in vivo a in vitro vektorové systémy nie sú ani zďaleka dokonalé . Ak je problém cudzieho dodania DNA in vitro prakticky vyriešený a jeho dodanie do cieľových buniek rôznych tkanív in vivoúspešne vyriešené (hlavne vytvorením konštruktov, ktoré nesú receptorové proteíny, vrátane antigénov špecifických pre určité tkanivá), potom ďalšie charakteristiky existujúcich vektorových systémov - integračná stabilita, regulovaná expresia, bezpečnosť - stále potrebujú vážne vylepšenia.

V prvom rade ide o stabilitu integrácie. Doteraz bola integrácia do genómu dosiahnutá iba použitím retrovírusových alebo adeno-asociovaných vektorov. Účinnosť stabilnej integrácie možno zlepšiť zlepšením génových konštruktov, ako sú systémy sprostredkované receptormi, alebo vytvorením dostatočne stabilných epizomálnych vektorov (t. j. štruktúr DNA schopných dlhodobého pobytu vo vnútri jadier). V poslednej dobe sa osobitná pozornosť venuje vytváraniu vektorov založených na umelých chromozómoch cicavcov. Vďaka prítomnosti základných štruktúrnych prvkov obyčajných chromozómov sú takéto minichromozómy v bunkách dlho zadržané a sú schopné niesť plnohodnotné (genomické) gény a ich prirodzené regulačné prvky, ktoré sú potrebné pre správne fungovanie. génu, v správnom tkanive a v správnom čase.

Génová a bunková terapia otvára skvelé vyhliadky na obnovu stratených buniek a tkanív a genetický inžiniersky dizajn orgánov, čo nepochybne výrazne rozšíri arzenál metód pre biomedicínsky výskum a vytvorí nové možnosti na zachovanie a predĺženie ľudského života.

Génová terapia dnes konečne začína ospravedlňovať nádeje, ktoré sa do nej kedysi vkladali. Za posledných šesť rokov sa v dôsledku zavedenia špecifických funkčných génov do častí tela pacienta podarilo obnoviť zrak u 40 pacientov s dedičnou slepotou. V boji proti rôznym formám leukémie sa dosiahli vynikajúce výsledky: zo 120 subjektov niekoľko pacientov dosiahlo remisiu, ktorá trvala tri roky. Génová terapia preukázala svoju účinnosť v boji proti hemofílii – dedičnému ochoreniu, ktoré niekedy vedie k smrti pacienta. Teraz pacient nemusí užívať lieky vo vysokých dávkach, ktoré zvyšujú zrážanlivosť krvi a majú nebezpečné vedľajšie účinky.

Pozitívne výsledky boli privítané s veľkým nadšením aj preto, že pred 15 rokmi po predčasnej smrti Jesseho Gelsingera, tínedžera so zriedkavou poruchou trávenia, bola génová terapia zastavená. Imunitný systém mladého muža zareagoval na zavedenie cudzieho génu tak prudko, že to telo nevydržalo. Úspech génovej terapie v 90. rokoch nebol ani zďaleka taký pôsobivý, ako sa očakávalo.

To všetko nás prinútilo prehodnotiť niektoré používané metódy a triezvejšie posúdiť možnosti využitia génovej terapie na odstránenie rôznych patológií. Musel som sa rozlúčiť s ilúziami a vrátiť sa k základnému výskumu. V prvom rade bolo potrebné zistiť príčinu možných vedľajších účinkov (ako tie, ktoré viedli k smrti Gelsingera) a naučiť sa, ako sa im vyhnúť. Väčšia pozornosť sa mala venovať komunikácii s pacientmi a ich príbuznými, aby ich rozhodnutie bolo vedomé.

Zlom nastal pred šiestimi rokmi po tom, čo génová terapia vyliečila osemročného chlapca Coreyho Haasa, ktorý trpel degeneratívnym ochorením oka. Spočiatku sa v dôsledku génových manipulácií začal v postihnutej sietnici ľavého oka produkovať chýbajúci proteín a už štyri dni po operácii chlapec navštívil ZOO a na svoju neopísateľnú radosť si uvedomil, že vidí modrá obloha a farebné balóny. O tri roky neskôr boli podobné manipulácie vykonané s pravým okom. Teraz Corey vidí tak dobre, že môže ísť na lov so svojím starým otcom.

Zatiaľ sa génová terapia nedostala do arzenálu praktizujúcich, no existuje nádej, že sa tak stane v najbližších desiatich rokoch. V roku 2012 sa v Európe uskutočnil pokus o jeho použitie na odstránenie zriedkavej, no mimoriadne bolestivej patológie, takzvaného familiárneho deficitu lipoproteínovej lipázy. Očakáva sa, že Spojené štáty získajú súhlas na používanie génovej terapie v medicíne v roku 2016 a potom budú musieť dohnať to, čo sa za desať rokov nečinnosti stratilo.

Kruté sklamanie

Neúspechy, ktoré postihli výskumníkov v počiatočných štádiách aplikácie génovej terapie v praxi, jasne ukázali, aké ťažké je predvídať všetky dôsledky zavedenia cudzích génov do tela. Príliš často nie sú najbezpečnejšie aplikačné systémy dostatočne účinné a niektoré z najefektívnejších aplikačných systémov sú nebezpečné: rozvinie sa hyperaktívna imunitná odpoveď, ako to bolo v prípade Gelsingera, alebo sa rozvinie leukémia.

Aby pochopili, čo spúšťa vedľajšie účinky a ako znížiť ich riziko, genetici sa zamerali na starostlivé štúdium najbežnejšieho systému prenosu génov: navrhnutie vírusov, ktoré fungujú ako mikroskopická injekčná striekačka.

V prvom rade bola odstránená významná časť vírusovej DNA, aby sa uvoľnilo miesto pre gény určené na zavedenie do tela pacienta. (Tento postup súčasne spôsobil, že vírus sa nemôže replikovať.) Transformovaný vírus nesúci cieľové gény bol vstreknutý do správnej časti tela, kde ich vložil do príslušných oblastí bunkovej DNA v závislosti od typu vírusu.

Počas obdobia, keď sa Gelsinger dobrovoľne zúčastnil klinických skúšok génovej terapie, boli najbežnejším systémom prenosu cudzích génov u ľudí adenovírusy, ktoré zvyčajne spôsobujú mierne infekcie horných dýchacích ciest. Podľa vedcov z Pennsylvánskej univerzity je najlepším výsledkom injekcia vírusu do pečene; práve tu sa nachádzajú bunky, ktoré produkujú tráviaci enzým, ktorý Gelsingerovi chýbal. Funkčná kópia génu pre tento enzým bola vložená do inaktivovanej vírusovej častice a bilión takýchto častíc bol vstreknutý do pacientovej pečene.

Žiaľ, niektoré častice sa dostali nielen do pečeňových buniek, ako sa predpokladalo, ale aj do obrovského množstva makrofágov - veľkých buniek, "sentry" imunitného systému, ako aj do dendritických buniek, čo ich upozornilo. o invázii zahraničných agentov. Imunitný systém okamžite začal ničiť všetky infikované bunky a tento násilný proces nakoniec pacienta zabil.

Závažnosť imunitnej odpovede vedcov ohromila. Nikto zo 17 ďalších dobrovoľníkov nič také nemal. Bolo známe, že adenovírus môže vyvolať imunitnú odpoveď, ale okrem jednej opice, ktorej bol injekčne podaný adenovírus mierne odlišný od vyššie opísaného, ​​bol Gelsingerov prípad jedinečný. „Ľudská populácia je oveľa heterogénnejšia ako populácia zvierat,“ hovorí James Wilson z Pennsylvánskej univerzity, ktorý vyvinul systém cieleného prenosu génov, ktorý bol použitý v Gelsingerových klinických štúdiách. „A v našom prípade jeden pacient v niečom výrazne odlišnom. od ostatných." Možno by k tragédii nedošlo, keby dávka vírusu bola menšia – nie bilión častíc, ale niekoľko miliárd. Ďalším nedostatkom bolo, že o smrti opice v podobných testoch nebol informovaný ani samotný pacient, ani jeho príbuzní a nikto nevedel, aké rozhodnutie by urobil, keby o incidente vedel.

Tragédia, ktorá sa stala Gelsingerovi, nebola posledná. Čoskoro sa uskutočnil pokus o odstránenie ďalšej patológie pomocou génovej terapie - ťažkej kombinovanej imunodeficiencie XI (SCID-X1). Testov sa zúčastnilo 20 detí; päť z nich dostalo leukémiu a jedno dieťa zomrelo. A opäť bol na vine dodávací systém, hoci v tomto prípade bol použitý iný vektor – retrovírus, ktorý vkladá cieľové gény priamo do bunkovej DNA. Ich presná poloha v genóme sa mierne líši a niekedy sa zapínajú v blízkosti onkogénu, čo za určitých podmienok vedie k vzniku rakoviny.

Revízia technológie

Tragické následky použitia retro- a adenovírusov ako vektorov nás prinútili obrátiť sa na iných nosičov. V dôsledku toho boli vybrané dva vírusy.

Prvý z nich, adeno-asociovaný vírus (AAV), nespôsobuje u ľudí žiadne infekcie. Väčšina z nás sa raz v živote stane jeho nositeľmi a práve preto naň imunitný systém pravdepodobne nezareaguje, keď bude pôsobiť ako vektor. AAV má ďalšiu vlastnosť, ktorá pomáha minimalizovať riziko vedľajších účinkov: je reprezentovaná mnohými odrodami (sérotypmi), z ktorých každá uprednostňuje infikovanie buniek svojho „vlastného“ orgánu alebo tkaniva. Takže pre AAV2 sú to oči, pre AAV8 pečeň, pre AAV9 srdcový sval a mozog. Je možné vybrať kmeň vírusu, ktorý je optimálny pre cieľovú časť tela a minimalizovať imunitnú odpoveď a iné nežiaduce účinky. Okrem toho AAVue začleňuje svoj genetický materiál do genómu hostiteľskej bunky, a preto nemôže spôsobiť rakovinu náhodnou aktiváciou onkogénov.

Adeno-asociovaný vírus bol prvýkrát testovaný na svoju schopnosť dodávať genetický materiál do cieľových tkanív v roku 1996. Testy boli vykonané na dobrovoľníkoch trpiacich cystickou fibrózou. Odvtedy bolo identifikovaných 11 sérotypov vírusu a z ich zložiek boli skonštruované stovky bezpečných, selektívnych vektorov. Vektory na báze AAV sa v súčasnosti testujú na génovú terapiu pri patológiách, ako je Parkinsonova a Alzheimerova choroba, ako aj hemofília, svalová dystrofia, srdcové zlyhanie a slepota.

Druhý vírus je prekvapivo oslabenou verziou vírusu ľudskej imunodeficiencie, pôvodcu AIDS. Zabudnime na chvíľu na jeho zlú povesť a zastavme sa pri jeho výhodách ako vektora. HIV je členom rodu Lentivirus z rodiny rstrovírusov. Ovplyvňuje bunky imunitného systému a – čo je veľmi dôležité – neaktivuje onkogény.

Ak odstránime gény zodpovedné za smrteľný účinok HIV, získame vynikajúci vektor so širokou škálou možností. Tak hovorí Stuart Naylor, bývalý vedecký riaditeľ anglickej spoločnosti Oxford Biomedica. Na rozdiel od menšieho AAV je „neutralizovaný“ HIV vhodný na prenos viacerých génov naraz. Je netoxický a nespôsobuje imunitnú odpoveď. Lentivírusy zbavené schopnosti spôsobiť infekciu sa testujú na možnosť ich použitia na odstránenie rôznych patológií, najmä adenoleukodystrofie. Dodnes sa viacerým chlapcom s touto diagnózou podarilo vrátiť do školy vďaka génovej terapii.

Súbežne s klinickými skúškami s použitím HIV AAVn prebiehajú práce na úprave starých vírusových vektorov tak, aby ich bolo možné za určitých okolností použiť. Retrovírusy (s výnimkou HIV) sú teda geneticky modifikované, aby nespôsobovali leukémiu.

Dokonca ani adenovírus, ktorého použitie viedlo k smrti Gelsingera, nebude úplne odmietnuté. Teraz sa podáva injekčne len do častí tela, kde je nepravdepodobné, že by vyvolal imunitnú odpoveď. Jednou z potenciálnych aplikácií je génová terapia pre xerotómiu (sucho v ústach) u pacientov vystavených žiareniu pri rakovine hlavy a krku. pri ktorých sú poškodené slinné žľazy.

National Institutes of Health vykonáva klinickú skúšku (zahŕňajúcu malý počet dobrovoľníkov) prístupu založenom na zavedení génov, ktoré sprostredkovávajú tvorbu kanálov na prechod vody do slinných žliaz, do príslušných buniek. Keďže posledne menované sú malé a viac-menej izolované a dávka vírusu je 1 000-krát menšia, ako raz dostal Gelsinger, pravdepodobnosť príliš silnej imunitnej reakcie je minimalizovaná. Vírusové častice, ktoré sa nedostali do cieľových buniek, by sa podľa vývojárov mali zničiť v slinách, vypľuť s nimi alebo prehltnúť, čo opäť znižuje riziko vzniku imunitnej odpovede. Od roku 2006 táto metóda výrazne zlepšila stav 11 pacientov.

Nové ciele

Lekárski genetici povzbudení úspechom rozšírili rozsah génovej terapie a snažili sa s jej pomocou odstrániť nededičné genetické defekty.

Napríklad Pensylvánska univerzita už tento prístup používa v boji proti jednej z najčastejších detských rakovinových chorôb – akútnej lymfoblastickej leukémii (ALL). Približne 20 % detí s touto diagnózou klasická chemoterapia nepomáha.

Génová terapia je v takýchto prípadoch obzvlášť zložitá a spolieha sa na použitie chimérických antigénnych receptorov (CAR). Podobne ako chiméry zo starogréckej mytológie, pozostávajúce z častí tela rôznych zvierat, sú tieto receptory komplexom dvoch zložiek imunitného systému, ktorý sa v tele bežne nenachádza. T bunky, ku ktorým je pripojený, získavajú schopnosť vyhľadávať špecifické proteíny nachádzajúce sa v leukemických bunkách vo väčšom množstve ako normálne bunky a ničiť abnormálne bunky. Prvými subjektmi boli dospelí pacienti s chronickou leukémiou: výsledky boli povzbudivé. Výsledok skúšok na chorých deťoch prekonal všetky očakávania.

Keď Emily Whitehead v máji 2010 diagnostikovali leukémiu, mala deväť rokov. Dva cykly chemoterapie zlyhali. Na jar 2012 bol podaný tretí kurz, ktorý mohol zabiť dospelého, ale dievča prežilo, hoci sa u nej objavili problémy s obličkami, pečeňou a slezinou. Tvrdí to ošetrujúci lekár Bruce Levine. "Emily bola na pokraji smrti."

Potom jej odobrali krv, izolovali T-bunky a vpichli im lentivírus. v genóme ktorých boli predtým zahrnuté cieľové gény. Po injekcii chimérických T buniek späť do tela pacientky sa jej stav začal rapídne zlepšovať. O tri týždne neskôr bolo 25 % T buniek v jej kostnej dreni geneticky upravených a začali „loviť“ rakovinové bunky. „V apríli dievča úplne oplešalo. - spomína Levin, - a v auguste nadobudol svoj pôvodný vzhľad a bol pripravený do školy.

Modifikované T bunky pravdepodobne nebudú fungovať po zvyšok jej života, ale postup sa môže vždy zopakovať. Medzitým je toto pekné dievča s hustými hnedými vlasmi bez rakovinových buniek. Na jeseň 2013 niekoľko skupín lekárskych genetikov informovalo o použití techniky CAR na liečbu 120 pacientov s rovnakou formou leukémie ako Emily Whitehead, ako aj s inými formami. Päť dospelých a 19 z 22 detí prešlo do remisie.

vyhliadky

Teraz čelia špecialisti na génovú terapiu ďalšej výzve: potrebujú získať súhlas od Úradu pre potraviny a liečivá (FDA), aby mohli na klinike používať svoj vektorový systém, ktorý je bezpečnejší ako ktokoľvek iný. Je potrebné zorganizovať klinickú skúšku fázy III, do ktorej by sa zapojila veľká skupina dobrovoľníkov. Zvyčajne to trvá jeden až päť rokov. Ku koncu roka 2013 dosiahlo túto fázu približne 5 % z 2 000 pokusov. Tvorcovia metódy liečby pacientov trpiacich Leberovou chorobou (obojstranná strata zraku v dôsledku mutácie mitochondriálnej DNA: osemročný Haas mal túto patológiu) pokročili ďalej ako ostatní. Už niekoľkým desiatkam pacientov sa pomocou génovej terapie podarilo obnoviť zrak.

Článok do súťaže "bio/mol/text": « Misha sa narodila 12. februára ako zdravé dieťa. Ale vo veku 1,5 mesiaca som si všimol, že na všetkých fotografiách má dieťa rovnakú polohu, ako keby jeho nohy boli nehybné. V priebehu niekoľkých týždňov sme boli diagnostikovaní, sympatizovali a odporučili nám začať plánovať druhé, zdravé dieťa.". Osudnou kombináciou génov bol Misha, podobne ako ostatné deti s touto chorobou, počas svojho krátkeho života nútený bojovať o každý pohyb. Bojujte zúfalo, zo všetkých síl, ale nakoniec prehrajte. spinálna svalová atrofia (SMA) je jednou z genetických anomálií, pred ktorou je ľudstvo stále bezmocné. Pokroky v génovej terapii, ktoré teraz lekársky svet sleduje, však môžu spôsobiť, že SMA aj iné závažné dedičné patológie budú liečiteľné. Navyše sú stále liečiteľné in utero.

Generálnym sponzorom súťaže je spoločnosť Diaem: najväčší dodávateľ zariadení, činidiel a spotrebného materiálu pre biologický výskum a výrobu.

Sponzorom ceny publika bolo Lekárske genetické centrum.

"Knižný" sponzor súťaže - "Alpina non-fiction"

Príroda robí chyby, človek ich opravuje

Koncept génovej terapie je elegantný a krásny, ako každý génius. Spočíva v dopravení zdravého genetického materiálu do bunky pomocou vektorových systémov, aby sa ním nahradili „chybné“ gény spojené s rôznymi chorobami (obr. 1).

"Biomolekula" už podrobne písala o tom, aké príležitosti otvára génová terapia pri liečbe rakoviny a dedičných anomálií, najmä retinitis pigmentosa.

A ak v 80. rokoch minulého storočia, keď sa o génovej terapii hovorilo dosť nahlas, mnohým sa jej teória zdala byť pokračovaním scenára k páske „Späť do budúcnosti“, dnes sa stala realitou, ktorá sa otvára nové, skutočne neobmedzené vyhliadky.

Je však zrejmé, že génová terapia má množstvo obmedzení, najmä pokiaľ ide o dedičné ochorenia. Po prvé, patologický proces v takýchto prípadoch môže začať aj in utero. V čase, keď je choroba definitívne diagnostikovaná – a to sa stáva niekedy aj roky po narodení dieťaťa – môže dôjsť k nezvratnému poškodeniu buniek a orgánov, čo výrazne zužuje terapeutické možnosti alebo ich dokonca anuluje.

Šanca na vyriešenie tohto problému sa objavila vďaka modernej prenatálnej diagnostike, ktorá umožňuje odhaliť chromozomálne chyby už v skorých štádiách tehotenstva. Po prijatí akéhokoľvek materiálu plodu pomocou invazívnych techník je možné rýchlo a spoľahlivo diagnostikovať genetické choroby. A v prípadoch s hemoglobinopatiami potreba invazívnych manipulácií úplne zmizne: na ich identifikáciu stačí preskúmať fetálnu DNA získanú z materských krviniek.

Moderné techniky prenatálnej diagnostiky v kombinácii s pokrokmi v génovej terapii poskytujú jedinečnú možnosť napraviť „chybu“ prírody a zasiahnuť do patologického procesu ešte pred nezvratným poškodením buniek. Zabezpečiť liečbu rôznych ochorení dieťaťa v maternici alebo aspoň obmedziť progresiu ochorenia s najväčšou pravdepodobnosťou môže fetálna génová terapia, alebo fetálna génová terapia.

Myšlienka fetálnej génovej terapie nie je ani zďaleka nová: len pár rokov po prvom pokuse o génovú terapiu u dospelých, v roku 1994, začali vedci vážne diskutovať o použití inovatívnej techniky v maternici. Dnes, keď sa liečba genetických chorôb v maternici takmer zmenila z fantastickej vyhliadky na realitu, bolo publikovaných množstvo prác, kde sa podrobne študovala fetálna génová terapia a jej výhody v porovnaní s génovou terapiou dospelých.

prenatálne proti postnatálne

Pri očakávaní otázok o vhodnosti vnútromaternicovej korekcie genetickej anomálie sa okamžite zastavme nad výhodami fetálnej génovej terapie v porovnaní s postnatálnou génovou terapiou.

Dostatok príležitostí na ovplyvňovanie orgánov a systémov

Je známe, že pri mnohých genetických ochoreniach (napríklad epidermolysis bullosa alebo cystická fibróza) môže byť takmer okamžite po narodení pomerne ťažké ovplyvniť hlavné väzby patologického procesu. Korekcia mutantných génov vo vyvíjajúcom sa plode umožňuje rýchly nárast populácie kmeňových buniek, poskytujúc veľkú zásobu transfekovaných buniek a v dôsledku toho výrazný terapeutický účinok.

Zjednodušená výroba klinického vektora nesúceho genetický materiál

Dávka vírusového vektora, ktorým sa prenáša genetický materiál, závisí od telesnej hmotnosti. Vďaka malej veľkosti plodu je možné dosiahnuť oveľa vyššiu biodistribúciu vektora pri rovnakom dávkovaní ako pri génovej terapii dospelých. To šetrí čas aj peniaze. Jednoduché porovnávacie údaje pomáhajú predstaviť si, aké významné sú úspory: napríklad plod v 14. – 16. týždni tehotenstva (optimálne obdobie pre vektorovú indukciu) váži približne 100 g, pričom priemerná telesná hmotnosť dospelého človeka je približne 60 kg.

Zvýšenie účinnosti terapie v dôsledku nižšej imunitnej odpovede

Množstvo štúdií preukázalo, že humorálna imunita voči adenovírusom a adeno-asociovaným vírusom (AAV) (obr. 2) určitých sérotypov, ktoré sa bežne používajú ako vektory, môže viesť k zlyhaniu expresie transgénu. To sa môže stať jednou z kritických prekážok úspešnej transplantácie.

Približne 50 % dospelých so získanou imunitnou odpoveďou na tieto vírusové vektory je ohrozených. Ale aj pri absencii citlivosti zavedenie vektora u dospelých často vedie k rozvoju imunitnej odpovede, ktorá znižuje trvanie a úroveň expresie transgénu. Takže po intramuskulárnej injekcii adenovírusového vektora s proteínovým génom dystrofín u dospelých myší s Duchennovou svalovou dystrofiou sa vyvinú protilátky proti dystrofínu, čo je spojené s významným znížením účinnosti expresie. Plod v maternici je súčasne imunologicky nezrelý, čo umožňuje doručiť vírusový vektor a transgénny produkt bez obmedzenia imunitnou odpoveďou.

Zjavné výhody fetálnej terapie v porovnaní s postnatálnou korekciou zaisťujú jej vyššiu účinnosť a účelnosť najmä pri ťažkých, život ohrozujúcich ochoreniach. Aj v prípadoch, keď nie je možné dosiahnuť úplné vyliečenie, môže fetálna génová terapia ovplyvniť patologické súvislosti ochorenia, uľahčiť jeho priebeh a zlepšiť prognózu. A preto sa práve ona môže stať jedinou terapeutickou alternatívou ukončenia tehotenstva pre tisíce rodín. Navyše, počet ochorení, ktoré možno potenciálne kontrolovať zavedením fetálnej génovej terapie do klinickej praxe, je skutočne enormný.

Vyhliadky a príležitosti

Predpokladá sa, že fetálna génová terapia dokáže kontrolovať mnohé nebezpečné patológie. Len malá časť z nich je uvedená v tabuľke 1.

Tabuľka 1. Choroby, ktoré možno kontrolovať fetálnou génovou terapiou .

Choroba	Liek na génovú terapiu	Cieľové bunky a/alebo orgán	Vek prejavu choroby	Prevalencia	Dĺžka života
cystická fibróza	CFTR (transmembránový regulátor)	Epitelové bunky dýchacieho traktu a čriev	Tretí trimester tehotenstva	1:4000	Asi 35 rokov
Duchennova svalová dystrofia	dystrofín	myocyty	2 roky	1:4500	25 rokov
spinálna svalová atrofia	SMN proteín	Motoneuróny	6 mesiacov (typ I)	1:10 000	2 roky
Hemofília	Koagulačný faktor VIII alebo IX	Hepatocyty	1 rok	1:6000
beta talasémia	Globin	RBC prekurzory	Až rok	1:2700	Do 20 rokov
Gaucherova choroba	Glukocerebrozidáza	Hepatocyty	9,5 roka	1:59 000	Menej ako 2 roky
Poruchy cyklu močoviny	Ornitín transkarbamyláza	Hepatocyty	2 dni	1:30 000	2 dni
Epidermolysis bullosa	kolagén typu VII	Keratinocyty	Narodenie	1:40 000	Pri správnej terapii, normálna dĺžka života
Hypoxická ischemická encefalopatia	Neurotrofické faktory	Kortikálne neuróny	Narodenie	1:1000	Pri správnej terapii, normálna dĺžka života
Ťažká intrauterinná rastová retardácia	placentárne rastové faktory	trofoblast	Plod	1:500	Niekoľko dní

Okrem toho niektoré z patológií, u ktorých sa dá očakávať, že budú kontrolované fetálnou terapiou, zahŕňajú:

• Poruchy imunitnej nedostatočnosti- Syndróm nahých lymfocytov, hypoplázia chrupavky, Chediak-Higashiho syndróm, chronické granulomatózne ochorenie, Kostmanov syndróm, nedostatok adhézie leukocytov, Omennov syndróm, Wiskott-Aldrichov syndróm.
• Hemoglobinopatie- Rh choroba, vrodená erytropoetická porfýria.
• Choroby spojené s nedostatkom aktivity enzýmov, - Gaucherova choroba, Krabbeho choroba, metachromatická leukodystrofia, mukopolysacharidózy, Volmanova choroba, Niemann-Pickova choroba.
• Iné- vrodená dyskeratóza, familiárna hemafagocytárna lymfohistiocystóza, infantilná osteopetróza, Shwachmanov-Diamondov syndróm atď.

Zoznam chorôb, ktoré môžu byť „na pleci“ fetálnej génovej terapie, je úžasný: táto technika pravdepodobne umožní zasahovať do patologických procesov spôsobených monogénnymi chorobami, ktoré boli predtým mimo kontroly človeka. Ich počet podľa Svetovej zdravotníckej organizácie dosahuje desaťtisíc. Napriek tomu je dôležité brať do úvahy množstvo obmedzení a predovšetkým riziká pre matku a plod spojené s vnútromaternicovou génovou terapiou.

Strach a riziká

Špecifické riziká prenatálneho prenosu génov sa zásadne líšia od rizík postnatálnej génovej terapie. Patria sem krátkodobé nežiaduce reakcie a dlhodobé postnatálne účinky. Ich význam je umocnený skutočnosťou, že hypoteticky môže mať fetálna génová expresia nepredvídateľný vplyv na prenatálny aj postnatálny vývoj.

Po prvé, samotný prenos je priamo spojený so zvýšením pravdepodobnosti potratu, chorioamnionitídy a predčasného pôrodu. Štúdie dokumentovali zápalové reakcie na vektor, najmä infiltráciu pečene a nekrózu pečene pri génovej terapii plodu oviec.

Úspech fetálnej génovej terapie môže neutralizovať fetálna imunitná odpoveď a to so sebou nesie určité riziká pre konečný výsledok. Humorálne a bunkové reakcie na zavedenie vektora alebo transgénneho proteínu cez transduktorové systémy buniek môžu eliminovať produkty prenosu alebo vyrovnať transgénnu expresiu. Štúdie zároveň preukázali závislosť sily imunitnej odpovede od gestačného veku. Významné imunitné odpovede na zavedenie lentivírusového vektora v ranom a strednom štádiu tehotenstva neboli zaregistrované, zatiaľ čo pri zavedení adenovírusového vektora v neskorších štádiách bola pozorovaná silná humorálna odpoveď proti kapsidovému antigénu.

Jedným z mimoriadne dôležitých problémov fetálnej génovej terapie je potenciálne riziko, ktoré vzniká pri prenose sekvencií darcovskej DNA na plod. Keďže integrácia vektora do zárodočných buniek je pravdepodobne náhodná, teoreticky by to mohlo mať katastrofálne následky pre plod. V skutočnosti sa dieťa, ktoré dostane darcovský genetický materiál in utero, narodí ako mutant. Etická zložka génovej terapie ruší mysle vedcov a teológov. Od narodenia najslávnejšej ovečky v dejinách vedy varuje posledná ovečka pred nebezpečenstvom, ktoré ľudstvu prináša zasahovanie do Božieho plánu.

Ďalším dôležitým aspektom je možnosť mutagenézy v bunkách plodu, ktorá vedie k defektu niektorého funkčného génu, čo môže v konečnom dôsledku spôsobiť nové, získané genetické ochorenie alebo zhubný nádor. Jeho pravdepodobnosť vyzerá ešte reálnejšie vzhľadom na údaje zo štúdie na myšiach, počas ktorej expresia génov u embryonálnych myší dala impulz k rozvoju nádoru pečene.

V tejto súvislosti nemusia byť náhodné výsledky dvoch štúdií preukazujúcich rozvoj závažných nežiaducich účinkov po úspešnej génovej terapii X-viazanej kombinovanej imunodeficiencie: v prvom prípade bol zaznamenaný prejav monoklonálneho lymfoproliferatívneho ochorenia a v druhom prípade proliferáciu alfa/beta T-buniek. V prvom aj druhom prípade sa retrovírusový vektor integroval v tesnej blízkosti génu LMO2 v proliferujúcich T bunkách.

Teoreticky génová terapia ex vivo môže byť bezpečnejšie ako in vivo vektor zavádzania plodu. Aj keď to nevylučuje možnosť mutagenézy v bunkách, ktoré sú retrovírusovo transdukované in vitro zavedenie mutagénu sa dá ľahšie určiť a kontrolovať. Tieto komplikácie však nemožno úplne vylúčiť.

Nakoniec fetálna génová terapia zvyšuje náchylnosť fetálnych buniek na transdukciu. Nízka hladina retrovírusovej transdukcie do progenitorov zárodočných buniek bola pozorovaná u mužských a ženských pohlavných žliaz po intraperitoneálnom podaní vektora embryám oviec a opíc. Analýza faktorov vedúcich k neúmyselnej transdukcii ukázala, že náchylnosť fetálneho tkaniva na ňu závisí od gestačného veku, s vyššou mierou transdukcie na začiatku tehotenstva.

Z pohľadu potenciálnych rizík je zrejmé, že fetálna génová terapia môže byť rozumnou liečbou len pri ťažkých genetických ochoreniach, pri ktorých nie sú iné možnosti nápravy. A medzi nimi, samozrejme, Gaucherova choroba, možnosť vnútromaternicovej génovej terapie preukázala nedávno publikovaná štúdia.

Prvá bola: Gaucherova choroba

V júli 2018 časopis prírodná medicína zverejnil výsledky štúdie na myšiach pod vedením Simona Waddingtona ( Simon Waddington) z Londýnskeho inštitútu zdravia žien. Výsledky práce preukázali účinnosť fetálnej génovej terapie pri liečbe neurodegeneratívnych ochorení a najmä Gaucherovej choroby. Toto je najbežnejšia forma medzi zriedkavými dedičnými fermentopatiami, ktorá je založená na nedostatku aktivity lyzozomálneho enzýmu. glukózová cerebrosidáza(obr. 3), spôsobené mutáciami v gen glukozylceramidáza. V závislosti od charakteru mutácií sa môže vyvinúť ťažká neuropatická forma ochorenia prejavujúca sa od dojčenského veku, alebo forma s pozvoľnejším nástupom a menej závažnými príznakmi. Zatiaľ čo ľahšie formy Gaucherovej choroby dobre reagujú na substitučnú liečbu, ťažká forma je stále smrteľná. Príznaky nevyliečiteľnej formy Gaucherovej choroby sa objavujú v prvých mesiacoch života a zahŕňajú progresívnu svalovú hypotenziu, oneskorený a regresný psychomotorický vývoj a iné neurologické príznaky.

Vo svojej štúdii Waddington et al preukázali, že intrakraniálne podanie adeno-asociovaného vírusového vektora 9 (AAV9) myším embryám na 16. deň gestácie viedlo k zvýšenej expresii glukózocerebrosidázy, ktorá zastavila neurodegeneráciu. Aktivita enzýmu v mozgu bola zároveň porovnateľná s aktivitou u zdravých myší. Napriek tomu, že chorým hlodavcom bol stále diagnostikovaný zápalový proces v mozgu, vyvíjali sa výrazne lepšie ako myši z kontrolnej skupiny, ktoré museli byť dva týždne po liečbe pre závažnosť ochorenia utratené.

Myši liečené fetálnou génovou terapiou žili najmenej 18 týždňov, boli plodné a mobilné. Je zaujímavé, že zavedenie vektora postnatálne tiež uľahčilo priebeh ochorenia, ale bolo menej účinné ako prenatálna expresia.

Keďže AAV9 bol schopný vstúpiť do mozgu z krvného obehu, Waddingtonov tím urobil ďalší experiment, v ktorom vstrekli výrazne vyššiu dávku vektora nie do mozgu, ale priamo do krvi fetálnych myší. Myši boli po expresii do značnej miery na nerozoznanie od zdravých myší, ale keďže ich životnosť bola v experimentálnych podmienkach len 55 dní, vedci nedokázali vyvodiť závery o dlhodobej účinnosti intravenóznej génovej terapie.

Waddingtonov experiment bol doteraz najkomplexnejší, počas ktorého sa na zvieratách uskutočňovala fetálna génová terapia. Dnes tím spolupracuje s korporáciou Apollo Therapeutics, ktorá spojila tri britské univerzity a tri veľké farmaceutické spoločnosti. Waddington a kolegovia sledujú nový cieľ: tentoraz čelia výzve získať predklinické údaje a potenciálne testovať liečbu na ľuďoch. A zatiaľ čo skeptici uvažujú o rozsahu fetálnej génovej terapie u ľudí, ktorý by sa mohol značne zúžiť nezaradením Gaucherovej choroby do prenatálnych testov, Waddingtonov tím je pripravený na budúcnosť. Budúcnosť, kde sa deti s Gaucherovou chorobou, Duchennovou chorobou, SMA a mnohými ďalšími zriedkavými, no dnes, žiaľ, nevyliečiteľnými chorobami môžu uzdraviť.

Literatúra

1. 12 metód na obrázkoch: genetické inžinierstvo. Časť II: nástroje a techniky;
Imunitné odpovede na vektory génovej terapie: vplyv na funkciu vektora a efektorové mechanizmy. Gene Ther. 11 S10-S17;
2. Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). Imunitná odpoveď na dystrofín plnej dĺžky dodávaný do DMD svalu vysokokapacitným adenovírusovým vektorom. Molekulárna terapia. 6 , 359-368;
3. Heather A. Hartman, Avery C. Rossidis, William H. Peranteau. (2018). In Utero génová terapia a úprava genómu. Curr Stem Cell Rep. 4 , 52-60;
4. Anna L. David, Donald Peebles. (2008). . Najlepšia prax a výskum klinického pôrodníctva a gynekológie. 22 , 203-218;
5. Súhrn z frontov génovej terapie. Nová stratégia na neutralizáciu hemofílie;
6. Charles Coutelle. (2008). Prečo sa obťažovať?: Stojí génová terapia in utero za námahu? . Molekulárna terapia. 16 , 219-220;
7. Mike Themis, Simon N. Waddington, Manfred Schmidt, Christof von Kalle, Yoahe Wang, et. kol., (2005). Onkogenéza po dodaní vektora lentivírusovej génovej terapie neprimátov fetálnym a neonatálnym myšiam. Molekulárna terapia. 12 , 763-771;
8. Európska spoločnosť pre génovú terapiu (ESGT) Tlačová správa, Bernd Gansbacher. (2003). Správa o druhej závažnej nežiaducej udalosti v klinickom skúšaní génovej terapie pre X-viazanú ťažkú ​​kombinovanú imunitnú nedostatočnosť (X-SCID). J. Gene Med.. 5 , 261-262;
9. Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. kol., (2018). Fetálna génová terapia pre neurodegeneratívne ochorenie dojčiat. Nat Med. 24 , 1317-1323.

Duchennova svalová dystrofia patrí medzi zriedkavé, no stále pomerne časté genetické ochorenia. Ochorenie je diagnostikované vo veku troch až piatich rokov, zvyčajne u chlapcov, prejavujúce sa najskôr len ťažkými pohybmi, v desiatom roku už človek s takouto myodystrofiou nemôže chodiť, do 20.–22. život končí. Je to spôsobené mutáciou génu dystrofínu, ktorý sa nachádza na X chromozóme. Kóduje proteín, ktorý spája membránu svalovej bunky s kontraktilnými vláknami. Funkčne ide o druh pružiny, ktorá zaisťuje hladké sťahovanie a celistvosť bunkovej membrány. Mutácie v géne vedú k dystrofii tkaniva kostrového svalstva, bránice a srdca. Liečba choroby má paliatívny charakter a môže len mierne zmierniť utrpenie. S rozvojom genetického inžinierstva je však svetlo na konci tunela.

O vojne a mieri

Génová terapia je dodávanie konštruktov založených na nukleových kyselinách do buniek na liečbu genetických chorôb. Pomocou takejto terapie je možné napraviť genetický problém na úrovni DNA a RNA zmenou procesu expresie požadovaného proteínu. Napríklad DNA s opravenou sekvenciou môže byť dodaná do bunky, z ktorej je syntetizovaný funkčný proteín. Alebo naopak, sú možné delécie určitých genetických sekvencií, čo tiež pomôže znížiť škodlivé účinky mutácie. Teoreticky je to jednoduché, no v praxi je génová terapia založená na najkomplexnejších technológiách práce s mikroskopickými objektmi a predstavuje súbor pokročilého know-how v oblasti molekulárnej biológie.

Injekcia DNA do pronuklea zygoty je jednou z prvých a najtradičnejších technológií na vytváranie transgénov. Injekcia sa vykonáva ručne pomocou ultratenkých ihiel pod mikroskopom so 400-násobným zväčšením.

"Gén dystrofínu, ktorého mutácie spôsobujú DMD, je obrovský," hovorí Vadim Zhernovkov, riaditeľ vývoja v biotechnologickej spoločnosti Marlin Biotech, kandidát biologických vied. - Zahŕňa 2,5 milióna párov báz, čo by sa dalo prirovnať k počtu písmen v románe Vojna a mier. A teraz si predstavte, že sme z eposu vytrhli nejaké dôležité stránky. Ak sú na týchto stránkach opísané významné udalosti, potom by už bolo ťažké porozumieť knihe. Ale s génom je všetko komplikovanejšie. Nie je ťažké nájsť ďalší výtlačok Vojny a mieru a potom by sa dali prečítať chýbajúce strany. Ale dystrofínový gén sa nachádza na X chromozóme a muži majú len jeden. V pohlavných chromozómoch chlapcov je teda pri narodení uložená iba jedna kópia génu. Nie je kam to vziať.

Nakoniec pri syntéze proteínov z RNA je dôležité zachovať čítací rámec. Čítací rámec určuje, ktorá skupina troch nukleotidov sa číta ako kodón, ktorý zodpovedá jednej aminokyseline v proteíne. Ak dôjde k delécii v géne fragmentu DNA, ktorý nie je násobkom troch nukleotidov, dôjde k posunu v čítacom rámci – zmení sa kódovanie. Dalo by sa to prirovnať k situácii, keď po vytrhnutých stranách v celej zostávajúcej knihe budú všetky písmená nahradené nasledujúcimi v abecednom poradí. Získajte abrakadabra. Je to to isté, čo sa stane s proteínom, ktorý nie je správne syntetizovaný.“

Biomolekulárna náplasť

Jednou z účinných metód génovej terapie na obnovenie normálnej syntézy proteínov je preskočenie exónu pomocou krátkych nukleotidových sekvencií. Spoločnosť Marlin Biotech už vyvinula technológiu na prácu s génom dystrofínu pomocou tejto metódy. Ako je známe, v procese transkripcie (syntéza RNA) sa najskôr vytvorí takzvaná prematrixová RNA, ktorá zahŕňa tak proteín kódujúce oblasti (exóny), ako aj nekódujúce oblasti (intróny). Ďalej začína proces zostrihu, počas ktorého sa oddelia intróny a exóny a vytvorí sa „zrelá“ RNA pozostávajúca len z exónov. V tomto momente môžu byť niektoré exóny zablokované, „zlepené“ pomocou špeciálnych molekúl. Výsledkom je, že zrelá RNA nebude mať tie kódujúce oblasti, ktorých by sme sa najradšej zbavili, a tak sa obnoví čítací rámec, syntetizuje sa proteín.

„Túto technológiu sme odladili in vitro,“ hovorí Vadim Zhernovkov, teda na bunkových kultúrach pestovaných z buniek pacientov s Duchennovou myodystrofiou. Ale jednotlivé bunky nie sú organizmus. Pri napádaní procesov bunky musíme naživo pozorovať následky, no nie je možné zapojiť ľudí do testov z rôznych dôvodov – od etických až po organizačné. Preto bolo potrebné získať model Duchennovej svalovej dystrofie s určitými mutáciami na laboratórnom zvierati.

Ako prepichnúť mikrokozmos

Transgénne zvieratá sú zvieratá získané v laboratóriu, v genóme ktorých sa cielene, vedome vykonávajú zmeny. Už v 70. rokoch 20. storočia sa ukázalo, že najdôležitejšou metódou na štúdium funkcií génov a proteínov je tvorba transgénov. Jednou z prvých metód získania plne geneticky modifikovaného organizmu bola injekcia DNA do pronuklea ("jadrového prekurzora") zygot oplodnených vajíčok. Je to logické, keďže najľahšie je modifikovať genóm zvieraťa na samom začiatku jeho vývoja.

Diagram ukazuje proces CRISPR/Cas9, ktorý zahŕňa subgenomickú RNA (sgRNA), jej oblasť pôsobiacu ako vodiaca RNA a nukleázový proteín Cas9, ktorý štiepi obe vlákna genómovej DNA v mieste označenom vodiacou RNA.

Injekcia do jadra zygoty je veľmi netriviálny postup, pretože hovoríme o mikrošupinách. Myšie vajce má priemer 100 µm a pronukleus má 20 µm. Operácia prebieha pod mikroskopom so 400-násobným zväčšením, no vstrekovanie je najručnejšia práca. Na „injekciu“ sa samozrejme nepoužíva tradičná striekačka, ale špeciálna sklenená ihla s dutým kanálikom vo vnútri, kde sa zbiera génový materiál. Jeden koniec sa dá držať v ruke, zatiaľ čo druhý je ultratenký a ostrý – voľným okom prakticky neviditeľný. Samozrejme, že takáto krehká konštrukcia z borosilikátového skla sa nedá dlhodobo skladovať, preto má laboratórium k dispozícii sadu prírezov, ktoré sa bezprostredne pred prácou kreslia na špeciálnom stroji. Používa sa špeciálny systém kontrastného zobrazovania buniek bez farbenia – zásah do pronuklea je sám o sebe traumatický a je rizikovým faktorom pre prežitie buniek. Ďalším takýmto faktorom by bola farba. Našťastie sú vajíčka celkom odolné, ale počet zygot, z ktorých vznikli transgénne zvieratá, je len niekoľko percent z celkového počtu vajíčok, ktorým bola vpichnutá DNA.

Ďalším krokom je chirurgický zákrok. Prebieha operácia transplantácie mikroinjektovaných zygot do lievika vajcovodu myši príjemcu, ktorá sa stane náhradnou matkou pre budúce transgény. Ďalej laboratórne zviera prirodzene prechádza tehotenským cyklom a rodí sa potomstvo. Zvyčajne je vo vrhu okolo 20 % transgénnych myší, čo tiež svedčí o nedokonalosti metódy, pretože obsahuje veľký prvok náhody. Pri injekcii nemôže výskumník presne kontrolovať, ako budú vložené fragmenty DNA integrované do genómu budúceho organizmu. Existuje vysoká pravdepodobnosť takýchto kombinácií, ktoré povedú k smrti zvieraťa v embryonálnom štádiu. Napriek tomu metóda funguje a je celkom vhodná na množstvo vedeckých účelov.

Rozvoj transgénnych technológií umožňuje produkovať živočíšne bielkoviny, ktoré sú žiadané farmaceutickým priemyslom. Tieto proteíny sú extrahované z mlieka transgénnych kôz a kráv. Existujú aj technológie na získavanie špecifických bielkovín z kuracích vajec.

DNA nožnice

Existuje však efektívnejší spôsob založený na cielenej úprave genómu pomocou technológie CRISPR/Cas9. "Dnes je molekulárna biológia trochu podobná ére námorných expedícií na veľké vzdialenosti pod plachtami," hovorí Vadim Zhernovkov. — Takmer každý rok v tejto vede existujú významné objavy, ktoré môžu zmeniť náš život. Napríklad pred niekoľkými rokmi mikrobiológovia objavili imunitu voči vírusovým infekciám u zdanlivo dlho skúmaného druhu baktérií. V dôsledku ďalších štúdií sa ukázalo, že bakteriálna DNA obsahuje špeciálne lokusy (CRISPR), z ktorých sa syntetizujú fragmenty RNA, ktoré sa môžu komplementárne viazať na nukleové kyseliny cudzích prvkov, napríklad DNA alebo RNA vírusov. Na takúto RNA sa viaže proteín Cas9, ktorý je nukleázovým enzýmom. RNA slúži ako vodítko pre Cas9, pričom označuje špecifickú časť DNA, v ktorej nukleáza robí rez. Asi pred tromi až piatimi rokmi sa objavili prvé vedecké práce, ktoré vyvinuli technológiu CRISPR/Cas9 na úpravu genómu.

Transgénne myši umožňujú vytvárať živé modely ťažkých ľudských genetických chorôb. Ľudia by mali byť týmto drobným tvorom vďační.

V porovnaní s metódou konštruktu s náhodnou inzerciou umožňuje nová metóda vybrať prvky systému CRISPR/Cas9 tak, aby presne zacielili RNA vodiče na požadované oblasti genómu a dosiahli cielenú deléciu alebo inzerciu požadovanej DNA. sekvencie. Pri tejto metóde sú možné aj chyby (vodiaca RNA sa niekedy pripojí na nesprávne miesto, na ktoré je zameraná), ale pri použití CRISPR/Cas9 je efektivita tvorby transgénov už okolo 80 %. „Táto metóda má široké perspektívy nielen pri tvorbe transgénov, ale aj v iných oblastiach, najmä v génovej terapii,“ hovorí Vadim Zhernovkov. „Technológia je však len na začiatku svojej cesty a je dosť ťažké si predstaviť, že v blízkej budúcnosti budú ľudia schopní opraviť génový kód ľudí pomocou CRISPR/Cas9. Pokiaľ existuje možnosť chyby, existuje aj nebezpečenstvo, že človek stratí nejakú dôležitú kódujúcu časť genómu.“

Mliečna medicína

Ruskej spoločnosti Marlin Biotech sa podarilo vytvoriť transgénnu myš, v ktorej sa úplne reprodukuje mutácia vedúca k Duchennovej svalovej dystrofii a ďalšou etapou bude testovanie technológií génovej terapie. Vytváranie modelov ľudských genetických chorôb na laboratórnych zvieratách však nie je jedinou možnou aplikáciou transgénov. V Rusku a západných laboratóriách sa teda pracuje v oblasti biotechnológie, ktorá umožňuje získať liečivé bielkoviny živočíšneho pôvodu dôležité pre farmaceutický priemysel. Ako producenti môžu pôsobiť kravy alebo kozy, u ktorých je možné meniť bunkový aparát na tvorbu bielkovín obsiahnutých v mlieku. Z mlieka je možné extrahovať liečivú bielkovinu, ktorá sa získava nie chemickou metódou, ale prirodzeným mechanizmom, čím sa zvýši účinnosť lieku. V súčasnosti boli vyvinuté technológie na získanie takých liečivých proteínov, ako je ľudský laktoferín, prourokináza, lyzozým, atrín, antitrombín a iné.