Liek pre gény

Dlhoročným snom lekárov je mať k dispozícii látky, ktoré by pôsobili na konkrétne gény, t.j. hlavnou príčinou mnohých chorôb. Na základe takýchto látok je totiž možné vytvárať lieky – skutočné „kúzelné guľky“, ktoré môžu ovplyvniť dedičný materiál rôznych infekčných agens bez poškodenia ľudského tela, ako aj potlačiť aktivitu onkogénov zodpovedných za rast malígnych buniek. Vytváranie takýchto látok, ktoré majú priamy vplyv na genetický materiál, je jednou z hlavných úloh molekulárnej biológie, pretože ich možno použiť na štúdium funkcií génov a v konečnom dôsledku aj na riadenie ich práce.

Ako však môžete zmeniť požadovaný genetický program? Všetky gény majú totiž podobné chemické zloženie a štruktúru: rozdiely medzi nimi sa redukujú len na rádovo striedanie štyroch monomérnych blokov – nukleotidov A, T, G, C. Aby na určitý gén pôsobila molekula látky musí nejako rozpoznať túto nukleotidovú sekvenciu - úloha na prvý pohľad neriešiteľná.

Ale skupina sibírskych chemikov, ktorí prišli do novosibirského Academgorodoku v prvých rokoch jeho vzniku, si myslela niečo iné. Na princípe molekulárneho rozpoznávania, ktorý využíva samotná príroda, pracovníci Ústavu organickej chémie Sibírskej pobočky Akadémie vied ZSSR (Novosibirsk) N.I. Grineva a skupiny D.G. Prvú prácu o oligonukleotidoch publikovali sibírski chemici v roku 1967 – tento dátum sa dnes považuje za oficiálny dátum vzniku nového smeru v molekulárnej biológii a farmakológii.

Boli prví

Realizáciu tohto projektu, neobvyklého svojou smelosťou (vtedy sa ešte nikde vo svete neplánovalo uskutočniť takýto výskum), v počiatočnej fáze realizovala malá skupina mladých zamestnancov, postgraduálnych študentov a študentov NSU. Museli sme začať prakticky od nuly, keďže v tom čase ešte nevedeli syntetizovať oligonukleotidy vo výrazných množstvách; neexistovali žiadne technické nástroje potrebné na prácu s malými množstvami nukleových kyselín a účinná metóda na určenie ich sekvencie. Našim chemikom sa tieto problémy podarilo vyriešiť vďaka interdisciplinárnosti – jednému z princípov, ktoré tvorili základ činnosti Sibírskej pobočky.

NIOC organizoval výrobu nukleových kyselín, vyvinul metódy ich chemickej modifikácie; spolu s pracovníkmi Ústavu jadrovej fyziky sa podarilo vytvoriť zariadenia na analýzu nukleových kyselín a manipuláciu s ich malými množstvami a spolu s chemikmi z Moskovskej štátnej univerzity začali pracovať na vytvorení automatických syntetizátorov oligonukleotidov. Výsledkom bolo, že vedci mali k dispozícii prakticky všetky potrebné analytické metódy a nástroje - biologický výskum sa mohol začať.

Experimenty uskutočnené najprv na jednoduchých modeloch a potom na prírodných nukleových kyselinách ukázali, že oligonukleotidy skutočne interagujú s cieľovými nukleovými kyselinami s vysokým stupňom selektivity. V prípade, keď sú k oligonukleotidom pripojené reaktívne skupiny, dochádza k cielenej chemickej modifikácii cieľových nukleových kyselín. Okrem toho sa prvýkrát preukázalo, že tieto reagencie môžu byť použité na potlačenie vírusových infekcií u zvierat a bola preukázaná možnosť ich zavedenia do tela cez kožu a sliznice atď.

Skoré publikácie o biologických účinkoch produkovaných oligonukleotidmi vzbudili veľký záujem medzi odborníkmi na celom svete. V roku 1988 sa v Akademgorodoku konalo prvé sympózium na svete o látkach zameraných na gény na báze fragmentov nukleových kyselín. Vedci z USA, Francúzska a potom ďalších krajín sa zapojili do práce na vytvorení takýchto liekov; Vznikli desiatky spoločností s cieľom vytvoriť terapeutické lieky na báze oligonukleotidov.

Doplnková medicína

Takzvané antisense oligonukleotidy, navrhnuté na selektívnu inaktiváciu vírusových RNA a niektorých bunkových RNA, sa stali prvými liečivami cielenými na gén. Spočiatku sa predpokladalo, že k týmto oligonukleotidom budú pripojené reaktívne skupiny, ktoré by mali chemicky modifikovať alebo zničiť cieľové nukleové kyseliny. Ukázalo sa však, že naviazanie oligonukleotidov na cieľovú RNA má na ňu samo o sebe taký silný vplyv, že môže vyvolať jej deštrukciu bunkovými enzýmami.

D. G. KNORRE - Akademik Ruskej akadémie vied, špecialista v oblasti chemickej kinetiky, molekulárnej biológie a bioorganickej chémie. Vedúci laboratória chémie prírodných polymérov (1960-1984), oddelenia biochémie a laboratória chémie nukleových kyselín (1970-1984) Ústavu organickej chémie Sibírskej pobočky Akadémie vied ZSSR, riaditeľ ústavu bioorganickej chémie Sibírskej pobočky Akadémie vied ZSSR a Sibírskej pobočky Ruskej akadémie vied (1984-1996). Antisense prístupy založené na použití nukleotidov a nukleových kyselín na potlačenie biologickej aktivity nukleových kyselín ponúkajú zaujímavé perspektívy v prípadoch, keď je potrebné potlačiť implementáciu nežiaducich informácií v živých organizmoch. V prvom rade sa otvára perspektíva vytvorenia novej generácie antivírusových a protinádorových liekov. Takéto lieky majú jednu nespornú výhodu oproti ostatným... Všetky oligonukleotidy, bez ohľadu na cieľ, na ktorý sú zamerané, je možné vytvoriť pomocou jedinej technológie. Je potrebné meniť len sekvenciu nukleotidov. Najmä vo virológii a onkológii sa často musíme vysporiadať s takým fenoménom, akým je vznik liekovej rezistencie. Stáva sa to najčastejšie preto, že jedna vírusová častica alebo jedna rakovinová bunka má mutáciu, ktorá vedie k takejto rezistencii. V každom inom prípade by sa malo začať s empirickým hľadaním nového lieku. V prípade antisense účinkov je potrebné len určiť, ktorá zmena štruktúry vírusového genómu alebo onkogénu viedla k vzniku rezistencie. Potom je okamžite jasné, ako vytvoriť nový liek pomocou rovnakej zjednotenej technológie *.

* Sorosov vzdelávací časopis. - 1998. - 12. - C. 25-31.

Interferujúce RNA, krátke dvojvláknové komplexy RNA oligonukleotidov, sa ukázali ako najsilnejší prostriedok na „vypnutie“ génov. Keď sa takýto komplex zavedie do bunky, jedno z vlákien sa naviaže na svoju komplementárnu sekvenciu v mediátorovej RNA bunky. To slúži ako signál na spustenie práce skupiny enzýmov, ktoré štiepia RNA spojenú s oligonukleotidmi. V dôsledku toho zmizne program na syntézu určitého proteínu.

V roku 2006 dostali dvaja americkí vedci Nobelovu cenu za fyziológiu alebo medicínu za vysvetlenie mechanizmu interferencie RNA. Vytvorenie regulátorov génovej expresie na báze interferujúcich RNA otvorilo veľké možnosti na získanie širokého spektra vysoko účinných netoxických liečiv, ktoré potláčajú expresiu takmer všetkých génov, vrátane nádorových a vírusových.

Správne mutácie

Pozornosť odborníkov už dlho priťahujú metódy mutagénneho pôsobenia na DNA pomocou oligonukleotidov alebo ich derivátov. V prípade úspechu sa to, čo sa dnes javí ako fantázia, môže stať skutočnosťou: náprava defektných genetických programov.

Už bolo experimentálne dokázané, že bodové mutácie môžu byť zavedené do genetických programov pomocou krátkych oligonukleotidov. Ako to spraviť? Mutagénne oligonukleotidy obsahujúce „nesprávne“ nukleotidové bloky sa zavedú do bunky, kde sa spoja s DNA. V dôsledku toho sa v niektorých častiach nukleotidových sekvencií objavujú „nesprávne“, t. j. nekomplementárne páry báz, čo systém bunkovej opravy („opravy“) DNA vníma ako poškodenie. Nukleotidy v takomto páre sú nahradené reparatívnymi enzýmami takým spôsobom, že sa stáva „správnym“, komplementárnym. V tomto prípade môže k náhrade dôjsť tak v oligonukleotidovej sekvencii, ako aj v samotnej bunkovej DNA.

V druhom prípade máme do činenia so zmenou genetického programu, teda s mutáciou. A hoci je účinnosť takéhoto mutačného procesu vo všeobecnosti nízka, možno ho použiť v súvislosti s novými bunkovými technológiami. Napríklad kmeňové bunky pacienta s nejakou dedičnou poruchou môžu byť ošetrené selektívnym mutagénom a potom tie z nich, v ktorých sa vyskytla požadovaná mutácia (t. j. bunky s „opraveným“ genetickým programom), môžu byť vybrané, namnožené. a zavádza sa do tela.

1967 Bola publikovaná prvá práca o oligonukleotidoch, génovo cielených biologicky aktívnych látkach

V súčasnosti existujúce oligonukleotidy sú teda schopné regulovať „prácu“ génov na rôznych úrovniach. Vyššie uvedené antisense oligonukleotidy a interferujúce RNA teda pracujú v štádiu proteínovej syntézy, pričom pôsobia na messengerové RNA – informačné molekuly, v ktorých sú zostavené polypeptidové reťazce. Antigénne oligonukleotidy, ktoré tvoria komplexy s DNA, potláčajú génovú expresiu – tvorbu samotných messengerových RNA a aptamérové ​​oligonukleotidy, podobne ako protilátky, môžu vytvárať väzby s určitými proteínmi a blokovať ich. Niektoré oligonukleotidy sú navyše schopné stimulovať imunitný systém – dnes sa používajú ako zložky vakcín.

V súčasnosti sa vývojom a syntézou oligonukleotidov a ich analógov zaoberajú veľké výskumné a priemyselné sektory. Len v minulom roku objem trhu s oligonukleotidmi určenými na výskumné účely presiahol 800 miliónov dolárov! V súčasnosti boli vyvinuté a syntetizované desiatky nových typov chemicky modifikovaných oligonukleotidov a testuje sa množstvo antivírusových a protizápalových liekov na ich základe. Výskum tohto druhu v Rusku sa v súčasnosti realizuje najmä v Ústave chemickej biológie a základnej medicíny Sibírskej pobočky Ruskej akadémie vied, kde pôsobia študenti a nasledovníci akademika D. G. Knorreho.

Takto plodnosť myšlienky, ktorá vznikla v sibírskej vetve pred štyridsiatimi rokmi, dokázal sám život. Použitím krátkych fragmentov nukleových kyselín ako základných štruktúr na vytváranie génovo cielených biologicky aktívnych látok je možné rýchlo vyvinúť a zaviesť do výroby špecifické liečivá proti takmer akémukoľvek vírusu. Na to je potrebné iba dešifrovať nukleotidovú sekvenciu vírusových génov, čo je ľahké urobiť pomocou moderných technológií. Tento univerzálny prístup má veľkú budúcnosť: výsledky štúdií z posledných rokov, najmä o cielenej mutagenéze, nám umožňujú počítať v blízkej budúcnosti s objavením sa účinných liekov na boj proti chorobám, ktoré sa stále považujú za nevyliečiteľné.

"Antisense" RNA (Antisense RNA), ktorá sa má použiť ako liek, je krátky (15-20 nukleotidov) oligonukleotid, ktorý sa môže viazať na určité miesto mRNA, ktoré je k nemu komplementárne, a inhibovať transláciu proteínu, ktorý kóduje, čím sa potlačí patologický proces (obr. 2).

Terapeutický účinok syntetických "antisense" oligonukleotidov závisí od špecifickosti ich hybridizácie s dostupným miestom cieľovej mRNA, odolnosti voči pôsobeniu bunkových nukleáz a prítomnosti transportného systému do bunky. 15-20-nukleotidové sekvencie hybridizujú s unikátnymi mRNA s pomerne vysokou špecifickosťou. Potenciálne cieľové miesta sú určené testovaním sady "antisense" oligonukleotidov s použitím bunkovej kultúry, ktorá syntetizuje cieľovú mRNA. Na tento účel sa uskutočňuje elektroforetická separácia bunkových proteínov, do ktorých sa počas translácie vloží rádioaktívna značka, a pomocou rádioautografie sa určí, v prítomnosti ktorého z „antisense“ oligonukleotidov je syntéza určitého proteínu znížená. Neexistujú žiadne všeobecné kritériá na výber najlepších cieľových miest v rôznych transkriptoch RNA. Účinné môžu byť oligonukleotidy, ktoré sú komplementárne k 5' alebo 3' koncom mRNA, k hraniciam exónu a intrónu a dokonca k dvojvláknovým oblastiam. Antisense oligonukleotidy môžu byť degradované intracelulárnymi nukleázami, preto je dôležité ich chrániť pred pôsobením nukleáz, aby nestratili svoju schopnosť hybridizovať s cieľom. Na tento účel je možné určitým spôsobom modifikovať pyrimidínové bázy, ribózu alebo deoxyribózu (obr. 3). V súčasnosti najpoužívanejšie „antisense“ oligonukleotidy je teda voľný atóm kyslíka fosfodiesterovej väzby nahradený skupinou SH (obr. 3B ), čo vedie k vytvoreniu tiofosfátovej väzby. Takto upravené oligonukleotidy sa rozpúšťajú vo vode, nesú negatívny náboj a neštiepia sa endonukleázami. Keď hybridizujú s cieľovým miestom, vytvárajú duplexy, ktoré aktivujú ribonukleázu (RNáza), endogénny enzým, ktorý štiepi mRNA v takejto hybridnej molekule. Uskutočnili sa prvé klinické skúšky takýchto oligonukleotidov - liekov "prvej generácie". Cieľmi sú RNA cytomegalovírusu, vírusu ľudskej imunodeficiencie, ako aj mRNA génov zodpovedných za rozvoj rakoviny, črevných ochorení a iných ochorení.

Syntetizované "antisense" oligonukleotidy s fosforamiditovými a polyamidovými (peptidovými) väzbami - peptidové nukleové kyseliny (Peptid nucleicacids, PNA) (obr. 3 V a D ). Takéto molekuly sú veľmi odolné voči pôsobeniu nukleáz. Chemické skupiny pripojené k 2'-uhlíkovému atómu cukrového zvyšku a C-5 atómu pyrimidínov tiež chránia antisense oligonukleotidy a uľahčujú ich väzbu na cieľové miesto (obr. 3 2D a E ). Všetky výhody týchto a iných modifikácií sa teraz intenzívne skúmajú.

Penetráciu "antisense" oligonukleotidov do bunky možno značne uľahčiť ich umiestnením do lipozómov. Tento vysoko účinný systém dodávania umožňuje použitie "antisense" oligonukleotidov v nízkych koncentráciách. Ak sú však lipozómy konjugované s protilátkami špecifickými pre epitopy určitých buniek určitých orgánov, potom bude možné uskutočniť cielené dodanie „antisense“ oligonukleotidov.

Vykonané predklinické testy ukázali, že "antisense" oligonukleotidy sú veľmi účinnými liekmi. Bola skúmaná možnosť ich použitia na liečbu stenózy koronárnych a krčných tepien, ktorá vedie k infarktu a mozgovej príhode. V týchto prípadoch sa často uchyľujú k angioplastike, expanzii tepien balónikovým katétrom, ale asi u 40 % pacientov sa stenózy po 6 mesiacoch opäť objavia, keďže angioplastika stimuluje proliferáciu buniek hladkého svalstva a sekréciu medzibunkových látok do vnútornej vrstva tepny v mieste jej expanzie. V jednom z experimentov boli antisense oligonukleotidy s tiofosfátovými väzbami, komplementárne k mRNA kódujúcim proteíny dôležité pre cicavčí bunkový cyklus, injikované do karotických artérií potkanov po angioplastike; v dôsledku toho sa frekvencia recidivujúcich stenóz znížila o 90 %. Proliferácia buniek hladkého svalstva sa vyskytuje aj pri ateroskleróze, diabetes mellitus, komplikáciách po operácii koronárneho bypassu. Pravdepodobne sa všetky tieto stavy dajú ovládať podobným spôsobom.

Antisense oligonukleotidy môžu byť tiež použité na liečbu vírusových infekcií a malárie. Okrem toho výsledky klinických skúšok fázy I na liečbu Crohnovej choroby s použitím orálneho podávania "antisense" oligonukleotidu ukázali jasný terapeutický účinok bez viditeľných vedľajších účinkov. V tomto prípade cieľová mRNA kódovala medzibunkovú adhéziu typu 1, ktorá je produkovaná v nadbytku u pacientov s Crohnovou chorobou. Je určený na skúmanie účinnosti rovnakého oligonukleotidu na liečbu iných zápalových ochorení, ako je reumatoidná artritída, psoriáza a ulcerózna kolitída.

V princípe môžu "antisense" oligonukleotidy tvoriť trojitú špirálu s chromozomálnou cieľovou DNA a blokovať transkripciu. Špecifickosť „antigénnych“ oligonukleotidov však zatiaľ nespĺňa normy prijaté pre lieky.

04.07.2013 - 31.12.2013

Bola vykonaná systematická analýza modernej literatúry k výskumnej téme. Boli stanovené sekvencie najsľubnejších z pohľadu realizátorov projektu oligonukleotidových derivátov a ich analógov, ktoré by mali vykazovať antivírusovú a antibakteriálnu aktivitu.
Boli vyvinuté spôsoby syntézy modifikovaných oligonukleotidov a ich konjugátov pomocou automatických syntetizátorov DNA/RNA alebo v režime manuálnej syntézy na pevnom podklade. Boli navrhnuté rôzne prístupy na navrhovanie oligonukleotidových derivátov s danou funkcionalitou, vrátane tých, ktoré sú založené na prediktívnej analýze štruktúry a stability vytvorených duplexov pomocou metódy molekulovej dynamiky. Navrhuje sa spôsob syntézy nových, predtým nepopísaných derivátov oligonukleotidov nesúcich modifikácie na atóme fosforu internukleotidovej fosfodiesterovej skupiny.
Bola vyvinutá technika na analýzu účinnosti penetrácie fluoresceínom značených zlúčenín do bakteriálnych buniek. Ukázalo sa, že kladne nabité deriváty Flu-(LR)4G-amidového peptidu účinne prenikajú a akumulujú sa v Pseudomonas aeruginosa, pričom účinnosť prieniku oligonukleotidov do nej bez transportného peptidu je nízka.
Všetky metódy vyvinuté počas výskumu, syntetické aj analytické, sú implementované v práci Laboratória biomedicínskej chémie ICBFM SB RAS. Získané teoretické poznatky sa využívajú vo vzdelávacích kurzoch.
Syntetická báza vytvorená v laboratóriu na získavanie, izoláciu a charakterizáciu oligonukleotidov je pre Ruskú federáciu unikátna a blíži sa k úrovni najlepších svetových výskumných laboratórií zodpovedajúcej špecializácie. Zapojenie biologických špecialistov robí laboratórium jedinečným z hľadiska potenciálu jeho výskumnej implementácie v smere vývoja antivírusových a antibakteriálnych liekov cielených na RNA.

Rozbaliť

01.01.2014 - 31.12.2014

i) Hodnotenie antibakteriálnej aktivity oligonukleotidových analógov/oligonukleotidových konjugátov proti Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Hodnotenie antivírusovej aktivity oligonukleotidových analógov/oligonukleotidových konjugátov proti chrípkovému vírusu WSN33/A/H1N1.
iii) výber sekvencií oligonukleotidových vedúcich analógov, ktoré vykazujú antibakteriálnu alebo antivírusovú aktivitu na požadovanej úrovni;
iv) Vývoj protokolov na syntézu oligonukleotidových konjugátov obsahujúcich skupiny, ktoré zvyšujú účinnosť ich akumulácie v eukaryotických alebo bakteriálnych bunkách
iv) Hodnotenie účinnosti penetrácie a akumulácie vyvinutých zlúčenín v bakteriálnych a eukaryotických bunkách.
v) pripravené laboratórium;
vi) Články vo vedeckých periodikách indexovaných Web of Science.
vii) abstrakty správ na konferenciách;
viii) dôkaz o účasti na vzdelávacích kurzoch;
ix) konferencia;

Rozbaliť

01.01.2015 - 31.12.2015

3.1 Antibakteriálna aktivita zlúčenín obsahujúcich vedúce sekvencie proti Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (v bunkovej kultúre);
3.2 Antivírusová aktivita zlúčenín obsahujúcich vedúce sekvencie proti vírusu chrípky in vitro;

3.3. Technologické a terapeutické charakteristiky vybraných oligonukleotidových analógov a konjugátov, berúc do úvahy spôsoby komercializácie liečiv, vrátane:

3.3.1 Zoznam štandardizovaných experimentálnych metód hodnotenia antibakteriálnej a antivírusovej aktivity prípravkov oligonukleotidových analógov in vitro (v bunkovej kultúre) a in vivo (na zvieracích modeloch);

3.3.3 Vybrané oligonukleotidové analógy a konjugáty, ktoré spolu s prejavom vysokej antibakteriálnej a antivírusovej aktivity sú schopné efektívneho prieniku a akumulácie v bunkách, vrátane:

3.3.2.1 Údaje o vstupe do buniek a ich dodaní pre modifikované oligonukleotidové analógy a konjugáty;
3.3.2.2 Optimalizovaná semipreparatívna syntéza, pre- a postsyntetické modifikácie, izolácia a kvantitatívna kontrola oligonukleotidových analógov vykazujúcich antibakteriálnu a antivírusovú aktivitu;
3.3.2.3. Hodnotenie vyvinutých zlúčenín s antibakteriálnou a antivírusovou aktivitou z hľadiska komerčného využitia.

3.4 Vypracovaná záverečná správa o projekte;
3.5 Pripravené laboratórium;

3.6 Abstrakty správ na konferenciách;
3.7 Potvrdenia o účasti na vzdelávacích kurzoch;

3.8 3články vo vedeckých periodikách indexované vo Web of Science

Väčšina metód génovej terapie ex vivo a in vivo využíva klonované genetické konštrukty, ktoré nahrádzajú funkčnú formu proteínu, ktorý nie je syntetizovaný v tele pacienta alebo je syntetizovaný v defektnej forme. Mnohé ľudské ochorenia (rakovina, zápaly, vírusové a parazitárne infekcie) sú však spojené, naopak, s nadprodukciou normálnej bielkoviny. Na liečbu týchto stavov boli vyvinuté terapie.

systémy využívajúce špecifické oligonukleotidy. Takýto malý oligonukleotid môže hybridizovať so špecifickým génom alebo mRNA a znížiť úroveň transkripcie alebo translácie, čím sa zníži množstvo proteínu zodpovedného za syntetizovanú patológiu. Oligonukleotid, ktorý hybridizuje so samotným génom a blokuje jeho transkripciu, sa nazýva "antigénny" a ten, ktorý hybridizuje so zodpovedajúcou mRNA, sa nazýva "antisense" (Antisense RNA). Aby sa zabránilo aktivácii transkripcie špecifických génov, môžu sa použiť aj dvojvláknové oligonukleotidy, ktoré sa špecificky viažu na proteíny viažuce DNA (aktivátorové proteíny). Nakoniec, aby sa znížilo množstvo určitej mRNA a na nej syntetizovaného proteínu, môžu sa použiť ribozýmy - prirodzené sekvencie RNA, ktoré sa viažu na špecifické molekuly RNA a štiepia ich.

V budúcnosti pravdepodobne nájdu široké uplatnenie lieky na báze nukleových kyselín, pričom hlavným predmetom vedeckého výskumu a klinických skúšok budú rôzne „antisense“ oligonukleotidy.

3.1 Antisense oligonukleotidy ako liečivá

"Antisense" RNA (Antisense RNA), ktorá sa má použiť ako liek, je krátky (15-20 nukleotidov) oligonukleotid, ktorý sa môže viazať na určité miesto mRNA, ktoré je k nemu komplementárne, a inhibovať transláciu proteínu, ktorý kóduje, čím sa potlačí patologický proces (obr. 2).

Terapeutický účinok syntetických "antisense" oligonukleotidov závisí od špecifickosti ich hybridizácie s dostupným miestom cieľovej mRNA, odolnosti voči pôsobeniu bunkových nukleáz a prítomnosti transportného systému do bunky. 15-20-nukleotidové sekvencie hybridizujú s unikátnymi mRNA s pomerne vysokou špecifickosťou. Potenciálne cieľové miesta sú určené testovaním sady "antisense" oligonukleotidov s použitím bunkovej kultúry, ktorá syntetizuje cieľovú mRNA. Na tento účel sa uskutočňuje elektroforetická separácia bunkových proteínov, do ktorých sa počas translácie vloží rádioaktívna značka, a pomocou rádioautografie sa určí, v prítomnosti ktorého z „antisense“ oligonukleotidov je syntéza určitého proteínu znížená. Neexistujú žiadne všeobecné kritériá na výber najlepších cieľových miest v rôznych transkriptoch RNA. Účinné môžu byť oligonukleotidy, ktoré sú komplementárne k 5' alebo 3' koncom mRNA, k hraniciam exónu a intrónu a dokonca k dvojvláknovým oblastiam. Antisense oligonukleotidy môžu byť degradované intracelulárnymi nukleázami, preto je dôležité ich chrániť pred pôsobením nukleáz, aby nestratili svoju schopnosť hybridizovať s cieľom. Na tento účel je možné určitým spôsobom modifikovať pyrimidínové bázy, ribózu alebo deoxyribózu (obr. 3). V súčasnosti najpoužívanejšie „antisense“ oligonukleotidy je teda voľný atóm kyslíka fosfodiesterovej väzby nahradený skupinou SH (obr. 3B ), čo vedie k vytvoreniu tiofosfátovej väzby. Takto upravené oligonukleotidy sa rozpúšťajú vo vode, nesú negatívny náboj a neštiepia sa endonukleázami. Keď hybridizujú s cieľovým miestom, vytvárajú duplexy, ktoré aktivujú ribonukleázu (RNáza), endogénny enzým, ktorý štiepi mRNA v takejto hybridnej molekule. Uskutočnili sa prvé klinické skúšky takýchto oligonukleotidov - liekov "prvej generácie". Cieľmi sú RNA cytomegalovírusu, vírusu ľudskej imunodeficiencie, ako aj mRNA génov zodpovedných za rozvoj rakoviny, črevných ochorení a iných ochorení.

Syntetizované "antisense" oligonukleotidy s fosforamiditovými a polyamidovými (peptidovými) väzbami - peptidové nukleové kyseliny (Peptid nucleicacids, PNA) (obr. 3 V a D ). Takéto molekuly sú veľmi odolné voči pôsobeniu nukleáz. Chemické skupiny pripojené k 2'-uhlíkovému atómu cukrového zvyšku a C-5 atómu pyrimidínov tiež chránia antisense oligonukleotidy a uľahčujú ich väzbu na cieľové miesto (obr. 3 2D a E ). Všetky výhody týchto a iných modifikácií sa teraz intenzívne skúmajú.

Penetráciu "antisense" oligonukleotidov do bunky možno značne uľahčiť ich umiestnením do lipozómov. Tento vysoko účinný systém dodávania umožňuje použitie "antisense" oligonukleotidov v nízkych koncentráciách. Ak sú však lipozómy konjugované s protilátkami špecifickými pre epitopy určitých buniek určitých orgánov, potom bude možné uskutočniť cielené dodanie „antisense“ oligonukleotidov.

Vykonané predklinické testy ukázali, že "antisense" oligonukleotidy sú veľmi účinnými liekmi. Bola skúmaná možnosť ich použitia na liečbu stenózy koronárnych a krčných tepien, ktorá vedie k infarktu a mozgovej príhode. V týchto prípadoch sa často uchyľujú k angioplastike, expanzii tepien balónikovým katétrom, ale asi u 40 % pacientov sa stenózy po 6 mesiacoch opäť objavia, keďže angioplastika stimuluje proliferáciu buniek hladkého svalstva a sekréciu medzibunkových látok do vnútornej vrstva tepny v mieste jej expanzie. V jednom z experimentov boli antisense oligonukleotidy s tiofosfátovými väzbami, komplementárne k mRNA kódujúcim proteíny dôležité pre cicavčí bunkový cyklus, injikované do karotických artérií potkanov po angioplastike; v dôsledku toho sa frekvencia recidivujúcich stenóz znížila o 90 %. Proliferácia buniek hladkého svalstva sa vyskytuje aj pri ateroskleróze, diabetes mellitus, komplikáciách po operácii koronárneho bypassu. Pravdepodobne sa všetky tieto stavy dajú ovládať podobným spôsobom.

Antisense oligonukleotidy môžu byť tiež použité na liečbu vírusových infekcií a malárie. Okrem toho výsledky klinických skúšok fázy I na liečbu Crohnovej choroby s použitím orálneho podávania "antisense" oligonukleotidu ukázali jasný terapeutický účinok bez viditeľných vedľajších účinkov. V tomto prípade cieľová mRNA kódovala medzibunkovú adhéziu typu 1, ktorá je produkovaná v nadbytku u pacientov s Crohnovou chorobou. Je určený na skúmanie účinnosti rovnakého oligonukleotidu na liečbu iných zápalových ochorení, ako je reumatoidná artritída, psoriáza a ulcerózna kolitída.

V princípe môžu "antisense" oligonukleotidy tvoriť trojitú špirálu s chromozomálnou cieľovou DNA a blokovať transkripciu. Špecifickosť „antigénnych“ oligonukleotidov však zatiaľ nespĺňa normy prijaté pre lieky.

5507 0

Dá sa to dosiahnuť niekoľkými spôsobmi: hybridizáciou zodpovedajúceho oligonukleotidu so špecifickým génom alebo mRNA, blokovaním proteínového transkripčného faktora, znížením množstva mRNA v dôsledku štiepenia enzýmami RNA atď. Zvážte princípy niektorých z nich.

Ribooligonukleotid, ktorý sa viaže na špecifickú mRNA a tým inhibuje transláciu proteínu, ktorý kóduje, sa nazýva "antisense" mRNA. Tento mechanizmus využívajú niektoré baktérie na reguláciu génov (obr. 3.20). V praxi sa používajú umelo navrhnuté gény, v ktorých je inzert DNA v takej orientácii, že ich transkripty sú antisense vzhľadom na cieľovú mRNA (obr. 3.21).

Ryža. 3.20. Regulácia génu pre bakterioferitín (bfr) pomocou antisense RNA

Ryža. 3.21. Inhibícia translácie mRNA syntetickým antisense oligonukleotidom

Ukázalo sa, že je možné použiť syntetické antisense oligonukleotidy, avšak ich terapeutický účinok bude silne závisieť od ich odolnosti voči pôsobeniu bunkových nukleáz, transportného systému a špecifickosti ich hybridizácie. Na určenie najúčinnejších cieľových miest na špecifickej mRNA sa testuje súbor antisense oligonukleotidov dlhých 15-20 báz s kultúrou buniek syntetizujúcich cieľovú mRNA. Zloženie syntetizovaných proteínov sa stanoví elektroforézou a stanoví sa, ktoré zavedenie oligonukleotidu vedie k zníženiu syntézy cieľového proteínu.

Na ochranu pred štiepením nukleázou sa syntetizujú modifikované oligonukleotidy, pričom nestrácajú schopnosť hybridizácie. Na obr. 3.22 ukazuje štruktúry modifikovaných nukleotidov, ktorých účinnosť sa intenzívne študuje. Napríklad sa ukázalo, že oligonukleotidy s nahradením voľného kyslíka fosfodiesterovej väzby sírou (štruktúra b) účinne hybridizujú s komplementárnou cieľovou RNA a výsledné duplexy RNA-DNA aktivujú intracelulárnu ribonukleázu H.

Tento endogénny enzým hydrolyzuje sekvenciu RNA v takýchto hybridoch. S takýmito oligonukleotidmi už prebehli sľubné klinické skúšky, ktorých cieľom bola RNA cytomegalovírusu, HIV a niektoré RNA zodpovedné za rozvoj rakoviny.

Ryža. 3.22. Oligonukleotidové modifikácie: a - normálna fosfodiesterová väzba; b - tiofosfátová väzba; c - fosfamidová väzba; d - 2"-0-metylribóza; e - C-5-propinylcytozín

Na efektívne dodávanie antisense oligonukleotidov sú často zabalené do lipozómov, ktoré sú zase modifikované špecifickými ligandmi, ktoré poskytujú cielené dodávanie (už sme videli túto techniku, keď sme uvažovali o metódach nevírusového dodania terapeutických génov). Doteraz bolo vykonaných množstvo testov a ukázalo sa, že vysoká terapeutická účinnosť antisense oligonukleotidov potláča nežiaducu proliferáciu buniek hladkého svalstva (komplikácie po angioplastike, koronárnom bypasse, ateroskleróze), pri liečbe vírusových infekcií a malárie. .

Princíp účinku a štruktúra ribozýmov – prirodzenej RNA s nukleázovou aktivitou, je znázornená na obr. 3.23.
Zistilo sa, že tieto krátkovláknové RNA sú schopné účinne potlačiť expresiu vírusových génov, onkogénov, rastových faktorov a iných terapeuticky dôležitých génov štiepením ich mRNA. Modifikáciou sekvencie viažucej substrát je možné získať ribozýmy špecifické pre konkrétnu mRNA. Ribozýmy môžu byť syntetizované priamo v bunke transkripciou syntetického oligodeoxyribonukleotidu kódujúceho katalytickú doménu a hybridizujúce oblasti, ktoré ju lemujú.

Ryža. 3.23. Štiepenie mRNA ribozýmami. Šípka ukazuje miesto štiepenia.

Takýto oligonukleotid je vložený do eukaryotického expresného vektora a umiestnený do bunky. Výsledná RNA spontánne získava aktívnu konformáciu, takzvaný tvar kladiva. Chemicky bolo syntetizovaných mnoho ribozýmov rôznych štruktúr a aktivít. Napríklad v laboratóriu nukleových kyselín Ústavu chemickej biológie a experimentálnej medicíny Sibírskej pobočky Ruskej akadémie vied (Novosibirsk) prebieha mnohoročný výskum na získanie syntetických ribozýmov so zvýšenou aktivitou a stabilitou.

Na zvýšenie ochrany pred predčasným štiepením intracelulárnymi nukleázami sa získavajú rôzne deriváty ribozýmov - s metylovanými 2"-hydroxylovými (pozri obr. 3.22, d) skupinami, binárnymi štruktúrami atď. Štruktúra molekuly ribozýmu výrazne ovplyvňuje jeho účinnosť. Obrázok Obr. 3.24 ukazuje kinetiku štiepenia mdr1 mRNA syntetizovanými ribozýmami rôznych štruktúr.

Ryža. 3.24. Štiepenie 190-mérneho 5'-koncového fragmentu mRNA MDR1 s modifikovanými binárnymi (1,3) a ribozýmami plnej dĺžky (2,4): a - štruktúra RNA s izolovaným špecifickým miestom; b - akumulácia produktov štiepenia ( materiály poskytnuté A.G. Venyaminova, IBKhiFM, Novosibirsk)

Osobitné miesto v molekulárnej terapii zaujímajú takzvané metódy aktivácie proliečiv. Napríklad jedným zo spôsobov génovej terapie rakoviny je deštrukcia nádorových buniek pomocou aktivovaného derivátu gancikloviru (GCV, derivát guanozínu), produktu génu tymidínkinázy, z vírusu herpes simplex HSVtk, o ktorom už hovoril. nás.

Nádorové bunky sú transfekované in vivo génom HSVtk pod aktívnym promótorom a po niekoľkých dňoch je podávaný ganciklovir, ktorý je fosforylovaný vírusovou tymidínkinázou na monofosfát a potom kinázami hostiteľských buniek na trifosfát. Tento derivát inhibuje DNA polymerázu a zastavuje syntézu DNA, čo vedie k smrti proliferujúcich buniek. Prostredníctvom medzibunkových kontaktov preniká ganciklovirtrifosfát do susedných nemodifikovaných buniek a ničí tak ďalších desať nádorových buniek.

Gén, ktorý vedie k smrti vlastnej bunky, sa nazýva „samovražedný“ gén (v našom prípade je to gén tymidínkinázy) a výraz „proliečivo“ označuje neaktívnu formu lieku (v tomto prípade ide o ganciklovir). Tento prístup sa použil na vytvorenie ďalších variantov kombinácie génový aktivátor-proliečivo, ale účinnosť systému GCV-HSVtk už bola preukázaná v množstve predklinických štúdií.

Génová terapia je nový medicínsky odbor, ktorého formovanie sa deje pred našimi očami. Napriek niektorým úspechom a sľubným vyhliadkam je tu množstvo výziev, ktoré treba prekonať.

Niektoré z problémov ležia ďaleko za hranicami medicíny a molekulárnej biológie. Ide o etické a politické otázky. Ako ste si už všimli, zvažovali sme metódy genetickej terapie iba pre somatické bunky. To znamená, že vykonané korekcie sú obmedzené na určitý orgán alebo tkanivo, „opravené“ gény sa neprenesú do ďalšej generácie. Zmeny v genotype zárodočných buniek (spermie alebo vajíčka) alebo oplodnených buniek sa musia prenášať z generácie na generáciu.

V súčasnosti je génová terapia somatických buniek klasifikovaná ako štandardná metóda lekárskej intervencie. Naproti tomu génová terapia zárodočných buniek je technologicky oveľa zložitejšia, problematickejšia a nepredvídateľnejšia. Preto sú experimenty v tejto oblasti v mnohých krajinách zakázané.

Koncom 80. rokov. V Spojených štátoch boli stanovené predpisy, ktorými sa riadia skúšky v oblasti genetickej terapie somatických buniek. Zaručujú nestranný a reprezentatívny výber pacientov a ich informovanosť (aká nebezpečná je liečba, aká je pravdepodobnosť jej úspechu a pod.), dôvernosť informácií o pacientoch a vykonaných štúdiách, vykonávanie všetkých manipulácií správne bez spôsobenia škody pre špecifických pacientov, ako aj pre ľudskú populáciu vo všeobecnosti.

Keďže liečba somatických buniek vedie k zlepšeniu stavu a výraznému predĺženiu života pacientov s genetickými ochoreniami, ale „vylepšený“ gén sa nededí, predpokladá sa, že to povedie k akumulácii genetických ochorení v ľudská populácia. Výrazné zvýšenie frekvencie škodlivého génu v dôsledku účinnej liečby však podľa populačnej genetiky trvá tisíce rokov.

NA. Voinov, T.G. Volova