Фагоцитоз иммунология. Фагоцитоз в иммунных реакциях организма
Процесс фагоцитоза (поглощения твердофазного объекта) состоит из пяти стадий.
- 1. Активация (усиление энергетического метаболизма). Факторами активации и хемотаксиса являются бактериальные продукды (ЛПС, пептиды), компоненты комплемента (С3 и С5), цитокины и антитела.
- 2. Хемотаксис.
- 3. Адгезия.
- 4. Поглощение.
- 5. Исход фагоцитоза.
Адгезия связана с наличием ряда рецепторов на поверхности фагоцитов (к Fc- фрагментам антител, компонентам комплемента, фибронектину), обеспечивающих прочность рецептор- опосредованных взаимодействий опсонинов, обволакивающих микроорганизмы и ограничивающих их подвижность (антитела, С3в, фибронектин).
Фагоциты обладают амебоподобными псевдоподиями. При поглощении образуется фагосома с поглощенным объектом (бактерией), к ней присоединяется и сливается содержащая литические ферменты лизосома, образуется фаголизосома.
Возможно три исхода фагоцитоза:
- - завершенный фагоцитоз;
- - незавершенный фагоцитоз;
- - процессинг антигенов.
Завершенный фагоцитоз- полное переваривание микроорганизмов в клетке- фагоците.
В процессе фагоцитоза происходит “окислительный взрыв” с образованием активных форм кислорода, что обеспечивает бактерицидный эффект.
К одной из важнейших функций макрофагов (наряду с хемотаксисом, фагоцитозом, секрецией биологически активных веществ) является переработка (процессинг) антигена и представление его иммунокомпетентным клеткам с участием белков главной системы гистосовместимости (МНС) класса 2.
Фагоцитоз - не только уничтожение чужеродного, но и представление антигена для запуска иммунных реакций и секреции медиаторов иммунных и воспалительных реакций. Система макрофагов- центральное звено не только естественной резистентности (видового иммунитета), но и играет важную роль в приобретенном иммунитете, кооперации клеток в иммунном ответе.
Воспаление как защитная реакция организма на различные повреждения тканей возникло на более высокой ступени эволюции, чем фагоцитоз и характерно для высокоорганизованных организмов, обладающих кровеносной и нервной системами.
Инфекционное воспаление сопровождается различными сосудистыми и клеточными (включая фагоцитоз) реакциями, а также запуском целого ряда медиаторов воспалительных реакций (гистамина, серотонина, кининов, белков острой фазы воспаления, лейкотриенов и простагландинов, цитокинов, системы комплемента).
Многие бактериальные продукты активируют клетки макрофагально - моноцитарной системы и лимфоциты, отвечающие на них выделением биологически активных продуктов- цитокинов, в частности интерлейкинов. Их можно характеризовать как медиаторы клеточных иммунных реакций. В воспалительных реакциях основную роль имеет интерлейкин-1 (ИЛ-1), стимулирующий лихорадку, повышающий проницаемость сосудов и адгезивные свойства эндотелия, активирующий фагоциты.
Лихорадка. Повышение температуры тела - защитная реакция организма, ухудшающая условия для размножения многих микроорганизмов, активирует макрофаги, ускоряет кровоток и усиливает обменные процессы в организме.
Барьерные функции лимфоузлов. По выражению П.Ф.Здродовского (1969) лимфоузлы- своеобразный биологический фильтр для возбудителей, переносимых с лимфой. Здесь проникшие через кожу или слизистые и занесенные током лимфы микроорганизмы задерживаются и подвергаются действию макрофагов и активированных лимфоцитов.
Система комплемента- комплекс белков и гликопротеидов сыворотки крови человека и позвоночных животных (их более 20). Отдельные компоненты опосредуют процессы воспаления, опсонизацию чужеродных фрагментов для последующего фагоцитоза, участвуют наряду с макрофагами в непосредственном уничтожении микроорганизмов и других чужеродных клеток (лизис бактерий и вирусов). В условиях физиологической нормы компоненты системы комплемента находятся в неактивной форме. Известны три пути активации системы комплемента- классический, альтернативный и с использованием С1- шунта.
Классический путь- каскад протеазных реакций с компонента С1q до С9, реализуется при наличии антител к соответствующему антигену. С комплексом “антиген- антитела” взаимодействует компонент С1q, затем С4, следом- С2. Образуется комплекс “антиген- антитела-С1С4С2”, с ним соединяется С3 (центральный компонент системы) и запускается цепь активации с эффекторными функциями (опсонизация и лизис бактерий, активация системы макрофагов, воспаление).
Альтернативный путь реализуется при первичном контакте с возбудителем (когда еще нет антител). Он индуцируется ЛПС и другими микробными антигенами. С1, С4, С2 не участвуют, альтернативный и классический пути смыкаются на уровне С3.
Система интерферонов.
Интерфероны- синтезируемые различными клетками организма гликопротеиды широкого спектра биологической активности (прежде всего антивирусной), быстрый ответ организма на получение клетками неспецифического сигнала чужеродности. Существует целая система интерферонов, которые разделены на альфа, бета и гамма подтипы с выраженной гетерогенностью свойств. Противовирусное действие проявляется в способности подавлять внутриклеточное размножение ДНК- и РНК- вирусов (прежде всего в результате блокировки синтеза вирусных макромолекул). Индукцию синтеза интерферонов вызывают вирусы, бактерии, риккетсии, простейшие, синтетические соединения.
Киллерные клетки.
В обеспечении видового иммунитета существенную роль принадлежит Т- цитотоксическим лимфоцитам (Т- киллерам), а также главной системе гистосовместимости (подробнее- в следующих лекциях).
Т- киллеры по представлению антигенов главной системы гистосовместимости класса 1 распознают любые чужеродные антигены (включая мутантные, например- раковые клетки), атакуют и уничтожают их.
Клетки NK (natural killer- натуральные киллеры) имеют важное значение в поддержании генетического гомеостаза и противоопухолевой защите, их функции распознавания не зависят от представления антигенов МНС (major histocompatibility complex) класса 1.
Системы неспецифической резистентности и видового иммунитета способствуют поддержанию структурной и функциональной целостности организма и являются основой для формирования приобретенного (специфического) иммунитета. Стыкуясь на этом, более высоком уровне, системы видового и приобретенного иммунитета образуют единую и наиболее эффективную систему самозащиты организма от всего чужеродного.
Иммунная система.
Иммунная система- совокупность органов, тканей и клеток, обеспечивающих клеточно-генетическое постоянство организма. Принципы антигенной (генетической) чистоты основываются на распознавании “своего чужого” и в значительной степени обусловлены системой генов и гликопротеидов (продуктов их экспрессии)- главным комплексом гистосовместимости (MHC), у человека часто называемой системой HLA (human leucocyte antigens). На лейкоцитах человека четко экспрессированы белки МНС, с помощью исследования лейкоцитов типируют антигены МНС.
Органы иммунной системы.
Выделяют центральные (костный мозг- кроветворный орган, вилочковая железа или тимус, лимфоидная ткань кишечника) и периферические (селезенка, лимфатические узлы, скопления лимфоидной ткани в собственном слое слизистых оболочек кишечного типа) органы иммунитета.
Клетки- предшественники иммунокомпетентных клеток продуцируются костным мозгом. Некоторые потомки стволовых клеток становятся лимфоцитами. Лимфоциты подразделяют на два класса- Т и В. Предшественники Т- лимфоцитов мигрируют в тимус, где созревают в клетки, способные участвовать в иммунном ответе. У человека В- лимфоциты созревают в костном мозге. У птиц незрелые В- клетки мигрируют в сумку (бурсу) Фабрициуса, где достигают зрелости. Зрелые В- и Т- лимфоциты заселяют периферические лимфоузлы. Таким образом, центральные органы иммунной системы осуществляют образование и созревание иммунокомпетентных клеток, периферические органы обеспечивают адекватный иммунный ответ на антигенную стимуляцию- “обработку” антигена, его распознавание и клональную пролиферацию лимфоцитов - антигензависимую дифференцировку.
Фагоцитоз - особый процесс поглощения клеткой крупных макромолекулярных комплексов или корпускулярных структур. «Профессиональные» фагоциты у млекопитающих - два типа дифференцированных клеток - нейтрофилы и макрофаги, которые созревают в костном мозгу из СКК и имеют общую промежуточную клетку-предшественника.Нейтрофилы циркулируют в периферической крови и составляют значительную часть лейкоцитов крови - 60-70%, или 2,5-7,5x109 клеток в 1 л крови. В норме нейтрофилы не выходят из сосудов в периферические ткани, но они первыми «бросаются» (т.е. подвергаются экстравазации) в очаг воспаления за счёт быстрой экспрессии молекул адгезии - VCAM-1 (лиганд на эндотелии VLA-4) и интегрина CDllb/CD18 (лиганд на эндотелии ICAM-1). На их наружной мембране идентифицированы эксклюзивные маркёры - CD66a и CD66d (раковоэмбриональные Аг).
Моноциты и макрофаги. Моноциты являются «промежуточной формой», в крови их 5-10% от общего числа лейкоцитов. Их предназначение - стать и быть оседлыми макрофагами в тканях.
Макрофаги печени - купферовские клетки, мозга - микроглия, макрофаги лёгких - альвеолярные и интерстициальные, почек - мезангиальные.
♦ Рецепторы мембраны макрофагов.
О CD115 - Рц для колониестимулирующего фактора моноцитов (M-CSF). Присутствует также на мембране полипотентной клетки-предшественника гранулоцитов и моноцитов и унипотентного предшественника моноцитов, о Известно 4 структуры - Рц на клеточной мембране макрофагов, связывающих то, что макрофаг потенциально способен поглотить по механизму фагоцитоза
CD14 - Рц для комплексов бактериальных ЛПС со связывающими липополисахариды белками сыворотки (LBP), а также комплексов ЛПС с другими микробными продуктами (например, с эндотоксинами).- Рц для связывания фрагментов фосфолипидных мембран и других компонентов собственных повреждённых и умирающих клеток (Рц для «мусора», scavenger receptors). Таков, например, CD 163 - Рц для «старых» эритроцитов. Рц, связывающий маннозу. Присутствует только на мембране тканевых макрофагов.
- Рц для комплемента - CR3 (интегрин CDllb/CD18) и CR4 (интегрин CDllc/CD18). Помимо комплемента, они связывают и ряд бактериальных продуктов: липополисахариды, липофосфогликан Leishmania, гемагглютинин из филаментов Bordetella, поверхностные структуры дрожжевых клеток родов Candida и Histoplasma.
CD64 - Рц для «хвостов» (Fc-фрагментов) IgG - FcyRI (Fcy-Рц первого типа), обеспечивающие возможность фагоцитоза макрофагами иммунных комплексов. Считаются мембранными маркёрами моноцитов/макрофагов, поскольку экспрессируются только на этих клетках. Подклассы IgG по силе связи с FcyRI располагаются в следующем порядке: IgG3 >IgGl >IgG4 >IgG2. о Рецепторы, осуществляющие взаимодействие с лимфоцитарным иммунитетом. Наряду с уже упомянутым CD64, к ним относят: - Рц для цитокинов, вырабатываемых иммунными лимфоцитами. Связывание с лигандами Рц для ИФНу и для фактора некроза опухоли (TNF) ведёт к активации макрофага. Через Рц для ИЛ-10 макрофаг, напротив, инактивируется. - CD40, В7, МНС-I/II - мембранные молекулы для контактов с комплементарными мембранными молекулами лимфоцитов, т.е.
для непосредственных межклеточных взаимодействий. У нейтрофилов таких рецепторов нет. Последствия фагоцитоза. После того, как фагоцит обхватывает своей мембраной поглощаемый объект и заключает его в мембранную везикулу, называемую фагосомой, происходят следующие события.
♦ Расщепление фагоцитированного материала. Этот процесс идёт по одинаковым биохимическим механизмам во всех фагоцитах, о Лизосомы - специальные внутриклеточные органеллы, содержащие набор гидролитических ферментов (кислых протеаз и гидролаз) с оптимумом рН примерно 4,0. В клетке лизосомы сливаются с фагосомами в фаголизосому, где и происходят реакции расщепления поглощённого материала.о Ферментные системы: НАДФ-Н-оксидазы, супероксиддисмутаза, NO-синтазы, которые генерируют активные формы неорганических окислителей, - пероксид водорода (Н202), супероксид анион (02-), синглетный кислород (1O2), радикал гидроксила (ОН-), гипохлорид (ОС1-), оксид азота (NO+). Эти радикалы также участвуют в деструкции фагоцитированного объекта.
♦ Секреция литических ферментов и окислительных радикалов в межклеточное пространство, где они также оказывают бактерицидное действие (но при этом поражают и собственные ткани).
Нейтрофилы, помимо уже названных веществ, продуцируют и секретируют коллагеназу, катепсин G, желатиназу, эластазу и фосфолипазу А2.
♦ Продукция и секреция цитокинов. Макрофаги и нейтрофилы, активированные микробными продуктами, начинают продуцировать цитокины и другие биологически активные медиаторы, создающие в очаге внедрения внешних субстанций доиммунное воспаление, которое подготавливает возможность развития лимфоцитарного иммунного ответа.
О Макрофаги продуцируют интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12); фактор некроза опухоли a (TNFa); простагландины; лейкотриен В4 (LTB4); фактор, активирующий тромбоциты (ФАТ).
о Нейтрофилы продуцируют TNFa, ИЛ-12, хемокин ИЛ-8, ЬТВ4 и ФАТ.
♦ Процессинг и представление Аг - образование внутри клеток комплексов из продуктов расщепления фагоцитированного материала с собственными молекулами МНС-II и экспрессия этого комплекса на поверхность клетки с «целью» представления Аг для распознавания Т-лимфоцитами. Этот процесс осуществляется только макрофагами.
16.Фагоцитарная реакция.
Фагоцитоз - процесс активного поглощения, переваривания и инактивации инородных частиц специализированными клетками-фагоцитами.
Стадии фагоцитоза :
Хемотаксис - целенаправленное передвижение фагоцитов по градиенту концентрации особых биологически активных веществ – хемоаттрактантов.
Адгезия – прилипание к микробу. Опсонины (АТ, фибронектин, сурфактант) обволакивают микроорганизмы и существенно ограничивают их подвижность.
Эндоцитоз (поглощение). В результате образуется фагосома с заключенным внутри объектом фагоцитоза. К фагосоме устремляются лизосомы и выстраиваются по ее периметру.
Перериваривание. Слияние фагосомы с лизосомой с образованием фаголизосомы. Далее фагоцитированные микрооргаизмы подвергаются атаке кослородзависимых (перекиси, супероксид кислорода, цитохром b; образуются продукты, обладающие токсическим действием, повреждающие микроорганизмы и окружающие структуры) и кислороднезависимых (гранулы с лактоферрином, лизоцимом и др.; эти продукты вызывают повреждение клеточной стенки и нарушение некоторых метаболитических процессов) факторов.
Результат фагоцитоза.
Завершенный – гибель и разрушение микроорганизмов
Незавершенный – бактерии, снабженные капсулами или плотными гидрофобными клеточными стенками, устойчивы к действию лизосомальных ферментов; блокировка слияния фагосом и лизосом.
Типы фагоцитирующих клеток:
Макрофаги и дендритные клетки – профессиональные фагоциты и антигенпрезентирующие клетки
Микрофаги – полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилы) – только умеренный фагоцитоз
Моноциты крови мигрируют в ткани под влиянием цитотоксинов и превращаются в резидентные.
Макрофаги.Печень – купферовские клетки
Легкие – альвеолярные макрофаги
ЦНС – микроглиальные клетки
Костный мозг – остеокласты
Почка – мезангиальные клетки
Фагоцитируют микроорганизмы и процессируют (переваривают) их; представляют АГ Т-клеткам.
NK – естественные киллеры – не диффиринцируют АГ, антителонезависимые, работают только против клеток и реагируют только на клеточные факторы.
Показатели фагоцитоза:
Фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность) – процент нейтрофилов, содержащих частицы микроорганизма
Фагоцитарное число (фагоцитарный индекс) – среднее число микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом.
17. Гуморальный иммунный ответ.
В гумаральных иммунных реакциях участвуют три клеточных типа: макрофаги (АГ-презентирующие клетки), Т-хелперы и В-лимфоциты
АГ-презентирующие клетки фагоцитируют микроорганизм и перерабатывают его, расщепляя на фрагменты (процессинг АГ). Фрагменты АГ выставляются на поверхность АГ-презентирующей клетки вместе с молекулой МНС. Комплекс АГ-молекула МНС2 предъявляется Т-хелперу. Распознание комплекса Т-хелпером стимулирует секрецию ИЛ-1 макрофагами.
Т-хелпер под действием ИЛ-1 синтезирует ИЛ-2 и рецепторы к ИЛ-2, последний по аутокринному механизму стимулирует пролиферацию Т-хелперов, а также ЦТЛ. Таким образом, после взаимодействия с АГ-презентирующей клеткой Т-хелпер преобретает способность отвечать на действие ИЛ-2 бурным размножением. Биологический смысл этого явления состоит в накоплении Т-хелперов, обеспечивающих образование в лимфоидных органах необходимого пула плазматических клеток, вырабатывающих АТ к данному АГ.
В-лимфоцит . Его активация предполагает прямое взаимодействие АГ с молекулой Ig на поверхности В-клетки. В этом случае сам В-лимфоцит перерабатывает АГ и представляет его фрагмент в связи с молекулой МНС2 на своей поверхности. Этот комплекс распознает Т-хелпер, отобранный при помощи того же АГ. Узнавание рецептором Т-хелпера комплекса АГ-МНС2 на поверхности В-лимфоцита приводит к секреции Т-хелпером ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5 и ИНФ-гамма, под действием которых В-клетка размножается, образуя клон плазматических клеток. Плазмоциты синтезируют АТ. Секрецию АТ стимулирует ИЛ-6, выделяемый активированным Т-хелпером. Часть зрелых В-лимфоцитов после антигеннезависимой дифференцировки циркулирует в организме в виде клеток памяти.
5 классов: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM; молекулы IgD, IgE, IgG представлены мономерами, IgM – пентамерами, молекула IgA в сыворотки крови - мономер, а в экскретируемых жидкостях (слюна, слезная жидкость) – димер
IgG: проникает через плаценту в организм плода, чтобы обеспечить формирование у плода пассивного иммунитета, после рождения ребенка содержание его в сыворотке крови падает и достигает минимальной концентрации к 3-4 мес., после чего начинает возрастать за счет накопления собственных IgG, достигая нормы к 7 годам. Обнаружение высоких титров IgG к Аг конкретного возбудителя указывает на то, что организм находится на стадии реконвалесценци или конкретное заболевание перенесено недавно.
IgM: его содержание значительно повышено у новорожденных, перенесших внутриутробную инфекцию. Наличие IgM в Аг конкретного возбудителя указывает на острый инфекционный процесс.
IgA: циркулирует в сыворотки крови, а также секретируется на поверхности эпителиев., присутствует в слюне, слезной жидкости, молоке. Молекулы IgA участвуют в реакциях нейтрализации и агглютинации возбудителей. Секреторные иммуноглобулины класса IgA (SIgA) отличаются от сывороточных наличием секреторного компонента, связанного с 2 или 3 мономерами IgA.
IgD: обнаруживают на поверхности развивающихся В-лимфоцитов, его содержание достигает максимума к 10 годам, некоторое увеличение титров отмечают при беременности, при бронхиальной астме, системной красной волчанке и у лиц с иммунодефицитами
IgE: синтезируется плазматическими клетками в бронхиальных и перитонеальных лимфатических узлах, в слизистой оболочке ЖКТ. IgE называются также реагинами, поскольку принимают участие анафилактических реакциях, обладая выраженной цитофильностью.
С 10-й недели внутриутробного развития начинается синтез IgM, с 12-й – IgG, с 30-й – IgA, но концентрация их невилика.
Защитная функция антител при инфекции:
Ат через Аг-связывающие центры взаимодействуют с различными Аг. Тем самым Ат предотвращают инфицирование или элиминируют возбудитель либо блокируют развитие патологических реакций, активируя при этом все системы специфической защиты.
Опсонизация (иммунный фагоцитоз) – Ат (через Fab-фрагменты) связываются с клеточной стенкой организма; Fc-фрагментом Ат взаимодействует с соответствующим рецептером фагоцита это опосредует последующее эффективное поглощение фагоцитом образовавшегося комплекса.
Антитоксический эффект – Ат могут связывать и, тем самым, инактивировать бактериальные токсины.
Активация комплимента – Ат (IgM, IgG) после связывания с Аг (микроорганизм, опухолевая клетка) активирует систему комплимента, что приводит к уничтожению этой клетки путем перфорации ее клеточной стенки, усиление хемотаксиса, хемокинеза и иммунного фагоцитоза
Нейтрализация – взаимодействуя с рецепторами клетки, связывающими бактерии или вирусы, Ат могут препятствовать адгезии и проникновению микроорганизмов в клетки организма-хозяина.
Циркулирующие иммунные комплексы – Ат связывают растворимые Аг и образуют циркулирующие комплексы, с помощью которых Аг выводятся из организма, преимущественно с мочой и желчью.
Антителозависимая цитотоксичность – опсонируя Аг, Ат стимулируют их разрушение цитотоксическими клетками. Аппарат, обеспечивающий распознавание мишеней – рецепторы к Fc-фрагментам Ат. Разрушать опсонированные мишени способны макрофаги и гранулоциты
Свойства антител:
Специфичность – способность антител вступать в реакцию только со специфическим антигеном, благодаря наличию антигенных детерминант на антигене и антигенных рецепторов (антидетерминант) на антителе.
Валентность – количество антидетерминант на антителе (обычно бивалентны);
Афинность, аффинитет – прочность соединения между детерминантой и антидетерминантой;
Авидность – прочность связи антитела с антигеном. Благодаря валентности осуществляется связь одного антитела с несколькими антигенами;
Гетерогенность – неоднородность, обусловлена наличием трех видов антигенных детерминант:
Изотипические – характеризуют принадлежность иммуноглобулина к определенному классу (IgA, IgG, IgM и др.);
Аллотипические – (внутривидовая специфичность) соответствуют аллельным вариантам иммуноглобулина (у гетерозиготных животных разные иммуноглобулины);
Идиотипические – отражают индивидуальные особенности иммуноглобулина (могут вызывать аутоиммунные реакции).
Возрастные особенности:
В постнатальном периоде наблюдается весьма существенная динамика по содержанию в крови детей иммуноглобулинов разных классов. Она связана с тем, что в течение первых месяцев жизни продолжается распад и удаление тех иммуноглобулинов класса в, которые были переданы трансплацентарно от матери.
В течение первых 4-6 мес материнские иммуноглобулины полностью разрушаются и начинается синтез собственных иммуноглобулинов.
Сущность фагоцитоза можно описать буквально в нескольких словах. При этом процессе особые клетки-фагоциты «вычисляют», пожирают и переваривают вредные частицы, попавшие в организм, главным образом инфекции . Цель явления состоит в том, чтобы защитить нас от потенциальных патогенов, токсинов и так далее. А как именно осуществляется механизм фагоцитоза? Он проходит в несколько этапов, о которых будет подробнее рассказано ниже.
Этапы фагоцитоза:
Хемотаксис
Вредоносный объект проникает в организм, и он недолго остается там незамеченным. Этот объект, будь то бактерия, инородное тело или что-то еще, выделяет особые вещества (хемоаттрактанты) и прямо контактирует с кровью или тканями. Все это ставит организм в известность о присутствии внутри него агрессора.
Возникает каскад биохимических реакций. На первой стадии фагоцитоза тучные клетки выбрасывают в кровь специальные соединения, вызывающие реакцию воспаления. Начало воспалительного процесса «пробуждает» от состояния покоя макрофаги и другие клетки-фагоциты . Нейтрофилы, уловив присутствие хемоаттрактантов, быстро выходят из крови в ткани и спешат мигрировать к воспалительному очагу.
Сложно это описать, а еще сложнее себе это представить, но проникновение патогена в организм ведет к запуску настоящего эффекта домино, включающего сотни (!) различных физиологических явлений, проходящих на клеточном и субклеточном уровнях. Состояние иммунной системы на этом этапе фагоцитоза можно сравнить с состоянием потревоженного пчелиного улья, когда его многочисленные обитатели готовятся атаковать обидчика.
Адгезия
Последовательность фагоцитоза продолжается второй стадией - реакцией адгезии. Подошедшие к нужному месту фагоциты протягивают к патогену свои отростки, вступают с ним в контакт и распознают его. Они не спешат сразу нападать и вначале предпочитают убедиться, не ошибаются ли они на счет «чужака». Распознание вредоносного агента происходит при помощи особых рецепторов на поверхности мембран фагоцитов.
Активация мембраны
На третьей стадии фагоцитоза в клетках-защитниках происходят невидимые реакции, которые подготавливают их к захвату и уничтожению патогена.
Погружение
Мембрана фагоцита - это текучая, пластичная субстанция, которая может менять форму. Что она и делает, когда клетка сталкивается с вредоносным объектом. На фото видно, что фагоцит протягивает к чужеродной частице свои «щупальца». Потом он постепенно растекается вокруг нее, наползает на нее и полностью ее захватывает.
Образование фагосомы
Когда фагоцит охватывает частицу со всех сторон, его мембрана замыкается снаружи, а внутри клетки остается закрытый пузырек с атакованным объектом внутри. Таким образом, клетка как будто проглатывает частицу. Этот пузырек носит название фагосомы.
Формирование фаголизосомы (слияние)
Пока проходили другие этапы фагоцитоза, внутри фагоцита готовилось к использованию его оружие - органеллы-лизосомы, содержащие «пищеварительные» ферменты клетки. Как только бактерия или другой вредный объект оказался пленен клеткой-защитником, к ней приближаются лизосомы. Их мембраны сливаются с оболочкой, обволакивающей частицу, и их содержимое изливается внутрь этого «мешка».
Киллинг
Это самый драматичный момент во всем механизме фагоцитоза. Захваченный объект переваривается и расщепляется фагоцитом.
Удаление продуктов расщепления
Все, что осталось от убитой бактерии или другой переваренной частицы, удаляется из клетки. Бывшая фаголизосома, представляющая собой мешочек с продуктами деградации, подходит к наружной мембране фагоцита и сливается с ней. Так из клетки удаляются остатки поглощенного объекта. Последовательность фагоцитоза завершается.
От чего зависит успешность фагоцитоза?
Увы, не всегда весь описанный процесс проходит как по маслу. В некоторых случаях патоген оказывается сильнее фагоцитарного звена иммунитета , он перебарывает защиту, и человек заболевает. Еще Мечников замечал, что если на личинок и червей подействовать слишком большим количеством грибковых клеток, то зараженные организмы погибают.
Другая возможная причина неудачи - незавершенный фагоцитоз . Некоторые (часто очень опасные и заразные) возбудители защищены от переваривания фагоцитами. В результате они просто проникают внутрь них, живут там и развиваются, недоступные для других факторов защиты иммунитета. Ведь «нормальная» иммунная система не будет атаковать собственные же клетки, она не знает, что внутри них - опасный возбудитель…
Чтобы избежать «неудачного» фагоцитоза и обеспечить наилучшую иммунную защиту, рекомендуется принимать препарат Трансфер Фактор . Его информационные молекулы передают клеткам иммунитета сведения о том, как вести себя с самыми разными патогенами и как от них избавляться. В результате работа иммунитета налаживается, а это повышает его устойчивость к еще не возникшим болезням и эффективность излечения от уже развившихся.
В литературе описано большое число методов количественной оценки фагоцитоза. Объем настоящей книги не позволяет подробно изложить все из них, поэтому мы ограничимся описанием лишь некоторых.
Материалы и оборудование
Для работы необходимо иметь:
Цитратдекстрозный антикоагулянт: 8 г лимонной кислоты,. 22 г трехзамещенного цитрата натрия (двухводного), 24,5 г глюкозы растворяют в 1 л воды;
Раствор декстрозодекстрана: 4,5 г NaCl, 25 г глюкозы, 30 г декстрана (отн. мол. масса 500 000) в 1 л;
Раствор хлористого аммония: 9 частей 0,83% хлористого аммония, 1 часть трис-НСl-буфера с рН 7,2 (20,6 г/л);
Смесь фиколл - визотраст: 9 г фиколла, 20 мл визотраста, 100 мл бидистиллированной Н 2 0, плотность 1,077;
Субстрат для β-глюкуронидазы: 31,5 мг паранитрофенил-β-глюкуронида и 100 мкм тритон X 100 растворяют в 100 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера с рН 5;
Реагенты для определения дефицита миелопероксидазы: фиксатор (10 мл 37% формальдегида с 90 мл абсолютного этанола), субстратный раствор (100 мл 30% ЭДТА, 0,3 г хлористого бензидина, 0,038 г ZnS0 4 x7H 2 0, 1 мл дистиллированной воды, 1,0 г CH 3 C00Nax3H 2 0, 0,7 мл 3% Н 2 0 2); подводят рН 1,0 М NaOH до 6,0.
Коммерческие реагенты:
ФСБ, раствор Хенкса и среда Игла-MEM (Гос. институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин-Вайсензее, ГДР);
Гепарин (5000 ЕД/мг) (Gedeon Richter, Венгрия);
Сыворотка эмбрионов коров (Flow Laboratories, США, можно другой фирмы);
Визотраст (VEB Fahlberg List, Magdeburg, ГДР);
Инфуколл (VEB Serumwerk Bernburg, ГДР);
Декстран, фиколл (Pharmacia, Швеция);
Коллоидный уголь Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, ФРГ);
Диизодецилфталат, парадиоксан (Coleman, Matheson and Bell, США);
Тритон X 100 (Serva, ФРГ, можно другой фирмы);
Масляный красный О (Allied chemical corp., Morristown, NY, США);
Иаранитрофенил-β-глюкуронид (Sigma, США);
Сафранин О (Fischer Scientific Lab., Chicago, США);
Полистироловые бусы, трубочки (Nunc, Дания);
Сетка F 905 (VEB Orvo Wolfen, ГДР).
Получение фагоцитов
Необходимые сведения о выделении гранулоцитов человека можно получить в главе "Разделение клеток иммунной системы "; получение перитонеальных макрофагов см. в разделах "Культивирование макрофагов и моноцитов " и "Выделение макрофагов из суспензии сплеиоцитов ". Детально этот вопрос рассматривается в ряде работ.
Кроме того следует еще упомянуть о следующих методах:
8 мл крови смешивают с раствором декстранглюкозы. Затем добавляют 6% раствор декстрана 75 в 0,15 М NaCl (5 мл). Смесь оставляют на 45-50 мин при комнатной температуре для седиментации эритроцитов. Отсасывают плазму. Остаточные эритроциты лизируют добавлением 0,83% хлористого аммония (35 мл к 15 мл плазмы). Центрифугируют 10 минут при 80g, суспендируют осадок в охлажденном до 0°С 0,15 М NaCl. Объединяют несколько осадков и центрифугируют 10 минут при 800 g. Клетки лучше сохранять на льду в 0,15 М NaCl (эта среда больше подходит, чем забуференные среды с бивалентными катионами, которые вызывают слипание клеток);
Если объектом фагоцитоза являются дрожжи, можно опустить стадию обработки хлористым аммонием, так как эритроциты не мешают процессу. Мононуклеары можно получать следующим образом: гепаринизированную кровь смешивают с 1 / 3 объема среды Игла, содержащей 15% глюкозы, наслаивают на слой смеси фиколл - визотраст и центрифугируют 20 мин при 400 g. Фракцию мононуклеаров отсасывают пастеровской пипеткой, дважды отмывают ФСБ и готовят суспензию на среде Игла (1х10 7 клеток/мл).
Приготовление частиц для фагоцитоза
Чаще используют живые культуры Staphylococcus aureus (SG 511 или 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli и другие энтеробактерии, листерии, коринебактерии, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Микроорганизмы выращивают 24 часа (при необходимости 48 ч) на твердых и жидких питательных средах. Собранную биомассу трижды отмывают 0,15М NaCl. Слишком густую взвесь измеряют при 640 нм, определяют концентрацию по калибровочной кривой.
Концентрацию микроорганизмов определяют также методами рассева на плотные питательные среды; в некоторых случаях подсчет микроорганизмов можно проводить в счетных камерах.
При работе с живыми бактериальными культурами следует обращать внимание на то, чтобы использовались всегда культуры на одной и той же стадии. Добавление 0,01%бычьий сывороточный альбуминспособствует выживаемости микроорганизмов. Изготовленная суспензия остается стабильной в течение 1-2 ч.
Убитые культуры микроорганизмов обычно получают нагреванием в течение 30 минут при 80 °С или обработкой текучим паром. Убитые микробы трижды отмывают 0,15 М NaCl, ресуспендируют и определяют концентрацию суспензии.
Приготовление пекарских дрожжей: 0,5 г пекарских дрожжей суспендируют в 0,15 М NaCl и помещают на 30 мин в кипящую водяную баню. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. При использовании живых дрожжей свежие клетки (4-5-дневная культура) трижды отмывают в среде Игла с добавлением 1,0% глюкозы. Обычно используют суспензию клеток 10 8 и 10 9 клеток/мл. Дрожжи используют в качестве тест-частиц при выявлении дефектов компонента С5.
Использование взвеси частиц полистирола: готовят 10% водную суспензию частиц полистирола диаметром 1,091 мкм. Разводят ее в соотношении 1 + 1 0,2% раствором БСА в 0,15 М NaCl, центрифугируют. При длине волны 253 нм суспензия полистирола 1 мкг/мл дает поглощение 1,17х10 -3 .
Применение суспензии липополисахарид - масляный красный О в минеральном масле: 2 г масляного красного растирают в 50 мл диизодецилфталата (или вазелиновое масло) в фарфоровой ступке. Центрифугируют 20 мин при 500 g. Добавляют 10 мкг надосадочной фракции к 10 мл диоксина, измеряют оптическую плотность на длине волны 525 им. Фактор пересчета равен 0,92. На втором этапе 40 мг липополисахарид (Е. coli 0,26 В6 и др.) растворяют в 3 мл 0,15 М NaCl. Затем добавляют к этой смеси 1 мл раствора масляного красного О в диизодецилсульфате, суспендируют смесь в течение 90 секунд. Суспензию используют немедленно, ее можно замораживать.
Для постановки реакции фагоцитоза в качестве тест-частиц можно использовать формалинизированные эритроциты.
Фагоцитоз бактерий, бактерицидность
Эксперимент с суспензией живых бактерий: обычно используют соотношение 3-10 микробов/фагоцит. В общем объеме 2 мл смешивают 1x10 6 фагацитов с 3х10 6 - 1х10 7 микробов. На практике к 1 мл суспензии фагоцитов, к которому было добавлено 8 ME гепарина, приливают 1 мл суспензии бактерий. Время взаимодействия составляет обычно 30 мин, в некоторых случаях оно больше. После инкубации отбирают 0,5 мл смеси, добавляют 1,5 мл 0,1% раствора желатина в растворе Хенкса, охлажденного до 0°С, и центрифугируют 3-4 мин при 300 g. Из осадка готовят мазки, которые окрашивают по Паппенгейму. Просматривают 200 клеток (по возможности трижды). Вычисляют процент фагоцитоза. По числу содержащихся в клетках бактерий рассчитывают индекс активности фагоцитоза: число фагоцитированных бактерий умножают на процент фагоцитирующих клеток; интенсивность фагоцитоза выражают числами от 1 до 4.
Степень 1: фагоцитировано I-4 бактерий
Степень 2: фагоцитировано 5-7 бактерий
Степень 3: фагоцитировано 8-10 бактерий
Степень 4: фагоцитировано более 10 бактерий на клетку
При определении уровня фагоцитоза живых микробов отдельно проверяют осадок клеток и надосадочную фракцию. Количество живых микробов определяют по рассеву на плотные питательные среды 0,1 мл исследуемых фракций. Инкубируют 24 (48) ч. При расчете бактерицидности исходят из того, что одна образовавшаяся колония соответствует одному живому микробу.
Для направленного изучения бактерицидности исследуют кровь пациентов и здоровых доноров с добавлением раствора антибиотиков (по 5000 ЕД пенициллина и стрептомицина/мл) и без него, а также проводят бактериальный контроль. Состав пробы: 0,3 мл раствора Хенкса+ 0,1 мл нормальной сыворотки, полученной из крови, взятой у 5 доноров, +0,5 мл суспензии лейкоцитов (10 7 клеток/мл) +0,1 мл суспензии микробов (10 6 микробов/мл). Раствор антибиотиков вносят по 0,02 мл в пробу. Инкубируют пробы при 37 °С и определяют число микробов через 20 минут, 1,5 часа и 3 часа. Для этого отбирают по 0,1 мл из каждой пробы, разводят отобранные аликвоты раствором Хенкса в 10, 100 и 1000 раз и наносят на подогретый агар. Иногда, особенно если были добавлены антибиотики, для точного подсчета микробов готовят промежуточные разведения (например, 0,2 мл пробы смешивают с 5 мл раствора Хенкса, центрифугируют 5 минут при 450 g, осадок растворяют в 1,9 мл ФСБ, наносят на агар). Если хотят сократить длительность бактериологического исследования, можно определять находящиеся внутри клетки микробы по флюоресценции при помощи окраски акридиновым желтым.
Фагоцитоз пекарских дрожжей: готовят суспензию 10 9 клеток/мл в 0,15 М NaCl. Смешивают 0,1 мл суспензии с 0,1 мл плазмы больного, инкубируют 30 мин при 37 °С, добавляют 0,2 мл (10 6) ПМЯЛ, инкубируют 30 мин. Отбирают аликвоты через интервалы от 5 до 30 мин. Просчитывают 100 ПМЯЛ и определяют число захваченных дрожжевых частиц на клетку. Известна следующая модификация: к 50 мкл сыворотки морской свинки добавляют 50 мкл исследуемой сыворотки (предварительно ее разводят в соотношении 1 + 1 средой Игла с глюкозой), добавляют 50-200 мкл суспензии лейкоцитов (10 7 клеток/мл) доводят объем до 450 мкл средой Игла с глюкозой и инкубируют 30 мин при 37 °С. Затем добавляют 50 мкл суспензии дрожжей (10 8 клеток/мл) перемешивают, инкубируют 40 минут при 37 °С. Вносят 50 мкл L- 75 Sе-метионина (общая активность 100 кБк) перемешивают и инкубируют 1 час при 37 °С. Осаждают клетки центрифугированием в течение 5 минут при 1000 g, отмывают их дважды ФСБ, измеряют радиоактивность на гамме-счетчике. Процент фагоцитированных дрожжей вычисляют по формуле:
Фагоцитоз с использованием раствора масляного красного в минеральном масле: 0,2 мл суспензии частиц смешивают с 0,8 мл клеточной суспензии, предварительно нагретой до 37°С. Через 5 минут инкубации добавляют 6 мл охлажденного до 0°С 0,15 М раствора NaCl, содержащего 126 мкг/кл N-этилмалеимида (для прекращения захвата частиц). Центрифугируют 10 минут при 250 g. Надосадочную фракцию отбрасывают, осадок ресуспендируют в растворе NaCl и N-этилмалеимида (см. выше), дважды отмывают клетки. Лизируют клетки ультразвуком, происходит высвобождение масляного красного. Добавляют 1 мл диоксана. Центрифугируют 15 минут при 500 g, измеряют оптическую плотность на волне 525 нм против чистого диоксана. Степень фагоцитоза (ИФ) определяют как количество минерального масла (мг), поглощаемого в минуту 10 7 клетками. Для подсчета можно использовать следующую формулу:
Исследование фагоцитоза в монослое макрофагов:
1. Фаза: в стерильные полистирольные пробирки вносят по 2 мл суспензии клеток (200 000 клеток/мл). Инокулируют 5 часов при 37°С, затем отмывают средой Игла. Вносят в пробирки 2 мл культуральной среды с 10% инактивированной (30 мин, 56 °С) сыворотки эмбрионов коров, инкубируют при 37 °С.
2. Фаза А: вносят суспензию микробов (3-10/макрофаг), инкубируют 30-60 мин при 37 °С, 6 раз ополаскивают пробирки порциями среды по 3 мл для удаления нефагоцитированных микробов. Немедленно фиксируют препарат смесью 1 части ледяной уксусной кислоты с 3 частями метанола. Окрашивают препарат по May - Griinwald, подсчитывают клетки.
Фаза Б: определение внутриклеточных живых бактерий. Последовательность операций та же, что и в фазе А до этапа фиксации. После отмывки тщательно удаляют все следы среды. Лизируют клетки, для чего вносят 2 мл 0,01% стерильного растворабычьий сывороточный альбумин(4°С), многократно встряхивают. Большая часть клеток лизируется через 20 минут. Высвободившиеся бактерии определяют путем рассева на плотные питательные среды.
Фагоцитоз эритроцитов: смешивают 4x10 7 фагоцитов с 5x10 7 тест-эритроцитов в 5 мл ФСБ. Переносят 2 мл смеси в охлажденный до 0°С 5 мМ фосфатный буфер и центрифугируют. Измеряют оптическую плотность надосадочной фракции при длине волны 420 нм. Степень фагоцитоза определяют по снижению содержания гемоглобина в бесклеточной фазе при помощи калибровочных кривых.
Упрощенный метод определения клиренса
Пример определения клиренса на крысах: животным вводят внутрибрюшиино по 5х10 7 микробов на 100 г веса (0,1мл/ /100 г). Оптимальная доза может колебаться от 10 6 до 10 8 на 100 г веса. С интервалом 1-2 часа из каждой группы экспериментальных животных забивают по 3 особи; общая продолжительность эксперимента 16 часив. Стерильно берут 0,5 мл крови из сердца, 1 мл перитонеальной жидкости, выделяют легкие, печень, селезенку и почки. Из ткани органов вырезают цилиндры пастеровской пипеткой. Определяют число микроорганизмов путем культивирования на жидких и твердых питательных средах.
Пример определения клиренса на мышах: используют коллоидный уголь или меченные 51 [Сг] эритроциты барана. Мышам (по меньшей мере 5 особей на опыт) внутривенно вводят по 0,01 мл суспензии угли из расчета 16 мг на 100 г веса. В течение 15 минут с интервалом в 2 минуты отбирают по 0,025 мл крови из ретроорбитального пространства. Отобранные 0,025 мл крови вносят в 2,0 мл 0,1% раствора Na 2 C0 3 . После гемолиза концентрацию угля определяют колориметрически на длине волны 675 нм при помощи калибровочных кривых.
t- время в минутах, С - концентрация углерода в пробе.
Корригированное значение фагоцитоза:
Функциональный скрининг фагоцитов
Определение дегрануляции (измерение активности (β-глюкуропидазы): 10 7 лейкоцитов суспендируют в 0,8 мл ФСБ в пластиковых пробирках, встряхивают 5 минут при 37 °С. Добавляют 0,2 мл сенсибилизированных ЛПС, флюорохромнрованных частиц (FC 80), охлаждают 30 мин на льду, центрифугируют 10 минут при 250 g. Проверяют активность фермента в надосадочной фракции. Инкубируют 0,9 мл субстратной смеси в течение 18 ч с 0,1 мл исследуемой фракции. Добавляют 2 мл 0,1М NaOH, измеряют оптическую плотность на волне 410 нм.
Расчет:
(ОП 410 х20)/(1,84х18) = число нмолей вещества, высвобождаемых за 1 час 10 7 лейкоцитами, т. е. степень дегрануляции выражают в наномолях паранитрофенил-β-глюкуронида.
Метод определения дефектов миелопероксидазы: наилучшие результаты дает биохимическое определение Н 2 0 2 , указывающее на изменения метаболизма в процессе фагоцитоза. Для практических целей весьма важно, что активация гексозо-монофосфатного шунта, восстановление тетразолиевого нитроеннего и связывание экзогенного йода с белками ПМЯЛ коррелируют с образованием Н 2 0 2 . Обычный мазок крови фиксируют 30 сек смесью алкоголь-формалин. Отмывают дистиллированной водой, и в течение 30 сек проводят окраску на пероксидазу. В содержащих пероксидазу клетках выявляются включения, окрашенные в темно-голубой цвет.
Проба на восстановление тетразолиевого нитросинего (ТНС). ТНС восстанавливается нормальными ПМЯЛ до формазана. Смешивают с 0,1 мл крови 0,1 мл 0,1% раствора ТНС в 0,15 М NaCl, инкубируют 20 минут при 37 °С, еще раз тщательно перемешивают. Включения формазана в клетки определяют микроскопией. Результат выражают в процентах формазан-позитивных клеток.
Несколько сложнее следующий метод: 1 каплю крови пациента наносят на покровное стекло. Инкубируют 20 минут при 37°С во влажной камере, затем осторожно отмывают стекло стерильным 0,15 М NaCl. Кладут покровное стекло на предметное, куда была нанесена 1 капля ТНС-среды (0,5 мл сыворотки + 0,3 мл стерильного 0,15 М NaCl + 0,6 мл ТНС, см. ранее). Инкубируют 30 минут во влажной камере при 37 °С, удаляют покровное стекло и высушивают на воздухе. В течение 60 секунд фиксируют абсолютным метанолом и отмывают дистиллированной водой. Окрашивают в течение 5 мин сафранином (1 г сафранина + 100 мл дистиллированной воды + 40 мл глицерина), отмывают. Формазан-позитивные клетки отличаются большими размерами, они напоминают бластные клетки и содержат голубые гранулы. Обычно в препарате определяется около 30% формазан-позитивных клеток.
Вышеприведенные методы оценки фагоцитоза представляют собой обобщение очень большого числа публикаций. Более детальную информацию по этим вопросам можно найти в соответствующих работах.