फॅगोसाइटोसिस पेशी केवळ संकुचित होऊन स्यूडोपोडिया तयार करण्यास सक्षम नसतात, ते धूळ कण, सूक्ष्मजंतू, मृत पेशींचे अवशेष, क्षीण झालेल्या पेशी यांसारखे परदेशी कण निश्चित करण्यासाठी लिफाफा प्लेट्स स्राव करतात. वस्तुस्थिती अशी आहे की ल्यूकोसाइट्स आणि इतर मोबाइल

इम्युनिटी इम्युनिटी (लॅट. इम्युनिटास - "एखाद्या गोष्टीपासून मुक्ती") हे शरीराचे अनुवांशिकदृष्ट्या परकीय जीव आणि पदार्थांपासून संरक्षण आहे, ज्यात सूक्ष्मजीव, विषाणू, वर्म्स, विविध प्रथिने, पेशी, स्वतःच्या बदललेल्या घटकांसह समाविष्ट असतात. लक्ष प्रतिरक्षा धन्यवाद

फागोसाइटोसिसच्या परिमाणवाचक मूल्यांकनासाठी मोठ्या संख्येने पद्धती साहित्यात वर्णन केल्या आहेत. या पुस्तकाची व्याप्ती आम्हाला त्या सर्वांचे तपशीलवार वर्णन करण्याची परवानगी देत ​​​​नाही, म्हणून आम्ही स्वतःला फक्त काही वर्णन करण्यापुरते मर्यादित करू.

साहित्य आणि उपकरणे

कार्य करण्यासाठी आपल्याकडे हे असणे आवश्यक आहे:

सायट्रेट डेक्सट्रोज अँटीकोआगुलंट: 8 ग्रॅम साइट्रिक ऍसिड. 22 ग्रॅम ट्रायसोडियम सायट्रेट (डायहायड्रेट), 24.5 ग्रॅम ग्लुकोज 1 लिटर पाण्यात विरघळतात;

डेक्स्ट्रोसोडेक्सट्रान सोल्यूशन: 4.5 ग्रॅम NaCl, 25 ग्रॅम ग्लुकोज, 30 ग्रॅम डेक्सट्रान (सापेक्ष आण्विक वजन 500,000) 1 l मध्ये;

अमोनियम क्लोराईड द्रावण: 9 भाग 0.83% अमोनियम क्लोराईड, 1 भाग Tris-HCl बफर pH 7.2 (20.6 g/l);

फिकॉलचे मिश्रण - व्हिसोट्रस्ट: फिकॉलचे 9 ग्रॅम, व्हिसोट्रस्टचे 20 मिली, बिडस्टिल्ड एच 2 0 100 मिली, घनता 1.077;

β-glucuronidase साठी सब्सट्रेट: 31.5 mg paranitrophenyl-β-glucuronide आणि 100 µM Triton X 100 0.05 M सोडियम एसीटेट बफर, pH 5 च्या 100 ml मध्ये विरघळतात;

मायलोपेरॉक्सीडेसची कमतरता निश्चित करण्यासाठी अभिकर्मक: फिक्सेटिव्ह (10 मिली 37% फॉर्मल्डिहाइड 90 मिली निरपेक्ष इथेनॉलसह), सब्सट्रेट सोल्यूशन (30% EDTA चे 100 मिली, बेंझिडाइन क्लोराईड 0.3 ग्रॅम, 0.038 ग्रॅम ZnS04 ml, 0.038 ग्रॅम X704 मिली. डिस्टिल्ड वॉटर, 1.0 ग्रॅम CH 3 C00Nax3H 2 0, 0.7 मिली 3% H 2 0 2); 1.0 M NaOH सह pH 6.0 वर समायोजित करा.

व्यावसायिक अभिकर्मक:

पीबीएस, हँक्स सोल्यूशन आणि ईगल-एमईएम माध्यम (स्टेट इन्स्टिट्यूट फॉर इम्यून प्रिपरेशन्स अँड कल्चर मीडिया, बर्लिन-वेइसेंसी, जीडीआर);

हेपरिन (5000 युनिट्स/मिग्रॅ) (गेडियन रिक्टर, हंगेरी);

फेटल बोवाइन सीरम (फ्लो लॅबोरेटरीज, यूएसए, किंवा दुसर्या कंपनीकडून);

Visotrust (VEB Fahlberg सूची, Magdeburg, GDR);

इन्फुकोल (VEB Serumwerk Bernburg, GDR);

डेक्सट्रान, फिकॉल (फार्मेसिया, स्वीडन);

कोलोइडल कार्बन Cl1/143a (वॅगनर, पेलिकनवेर्के, जर्मनी);

Diisodecyl phthalate, paradioxane (Coleman, Matheson and Bell, USA);

ट्रायटन एक्स 100 (सर्वा, जर्मनी किंवा अन्य कंपनीकडून);

ऑइल रेड ओ (अलाईड केमिकल कॉर्प., मॉरिसटाउन, एनवाय, यूएसए);

Iaranitrophenyl-β-glucuronide (सिग्मा, यूएसए);

Safranin O (फिशर सायंटिफिक लॅब., शिकागो, यूएसए);

पॉलीस्टीरिन मणी, नळ्या (नंक, डेन्मार्क);

जाळी F 905 (VEB Orvo Wolfen, GDR).

फॅगोसाइट्स मिळवणे

मानवी ग्रॅन्युलोसाइट्सच्या अलगावबद्दल आवश्यक माहिती "प्रतिरक्षा प्रणालीच्या पेशींचे पृथक्करण" या अध्यायात मिळू शकते; पेरिटोनियल मॅक्रोफेज मिळविण्यासाठी, "मॅक्रोफेज आणि मोनोसाइट्सची लागवड" आणि "स्प्लीओसाइट्सच्या निलंबनापासून मॅक्रोफेजचे अलगाव" विभाग पहा. या समस्येवर अनेक कामांमध्ये तपशीलवार चर्चा केली आहे.

याव्यतिरिक्त, खालील पद्धती देखील नमूद केल्या पाहिजेत:

डेक्सट्रान ग्लुकोज द्रावणात 8 मिली रक्त मिसळले जाते. नंतर 0.15 M NaCl (5 ml) मध्ये dextran 75 चे 6% द्रावण घाला. लाल रक्तपेशींच्या अवसादनासाठी मिश्रण खोलीच्या तपमानावर 45-50 मिनिटे सोडले जाते. प्लाझ्मा बाहेर शोषला जातो. ०.८३% अमोनियम क्लोराईड (३५ मिली ते १५ मिली प्लाझ्मा) घालून अवशिष्ट लाल रक्तपेशी नष्ट केल्या जातात. 80g वर 10 मिनिटे सेंट्रीफ्यूज करा, 0.15 M NaCl 0°C पर्यंत थंड झालेल्या गाळाला निलंबित करा. 800 ग्रॅम वर 10 मिनिटे अनेक गाळ आणि सेंट्रीफ्यूज एकत्र करा. पेशी बर्फावर 0.15 M NaCl मध्ये उत्तम प्रकारे ठेवल्या जातात (हे माध्यम बायव्हॅलेंट केशन्ससह बफर केलेल्या माध्यमांपेक्षा अधिक योग्य आहे, ज्यामुळे सेल क्लंपिंग होतात);

जर फागोसाइटोसिसची वस्तु यीस्ट असेल तर, अमोनियम क्लोराईड उपचाराची पायरी वगळली जाऊ शकते, कारण लाल रक्तपेशी प्रक्रियेत व्यत्यय आणत नाहीत. मोनोन्यूक्लियर पेशी खालीलप्रमाणे मिळू शकतात: हेपरिनाइज्ड रक्त 15% ग्लुकोज असलेल्या गरुड माध्यमाच्या 1/3 प्रमाणात मिसळले जाते, फिकॉल-व्हिसोट्रस्ट मिश्रणाच्या थरावर स्तरित केले जाते आणि 400 ग्रॅमवर ​​20 मिनिटे सेंट्रीफ्यूज केले जाते. मोनोन्यूक्लियर पेशींचा अंश पाश्चर विंदुकाने एस्पिरेट केला जातो, पीबीएसने दोनदा धुतला जातो आणि ईगलच्या माध्यमात (1x10 7 पेशी/मिली) निलंबन तयार केले जाते.

फॅगोसाइटोसिससाठी कण तयार करणे

स्टॅफिलोकोकस ऑरियस (एसजी 511 किंवा 502 ए), स्टॅफिलोकोकस एपिडिडर्मिडिस एसजी 475, ई. कोली आणि इतर एन्टरोबॅक्टेरिया, लिस्टरिया, कॉरिनेबॅक्टेरिया, कॅन्डिडा अल्बिकन्स, सॅकॅरोमायसेस सेरेव्हिसिया या बहुतेक वेळा वापरल्या जातात. घन आणि द्रव पोषक माध्यमांवर सूक्ष्मजीव 24 तास (आवश्यक असल्यास 48 तास) वाढतात. गोळा केलेले बायोमास 0.15 M NaCl ने तीन वेळा धुतले जाते. निलंबन खूप जाड असल्यास, 640 nm मोजा आणि कॅलिब्रेशन वक्र वापरून एकाग्रता निश्चित करा.

सूक्ष्मजीवांची एकाग्रता घन पोषक माध्यमांवर चाळणीच्या पद्धतींद्वारे देखील निर्धारित केली जाते; काही प्रकरणांमध्ये, सूक्ष्मजीव मोजणी कक्षांमध्ये मोजले जाऊ शकतात.

जिवंत जिवाणू संस्कृतींसोबत काम करताना, एकाच टप्प्यावर संस्कृतींचा नेहमी वापर करण्याची काळजी घेतली पाहिजे. 0.01% बोवाइन सीरम अल्ब्युमिनची जोडणी सूक्ष्मजीवांच्या अस्तित्वाला प्रोत्साहन देते. तयार केलेले निलंबन 1-2 तास स्थिर राहते.

सूक्ष्मजीवांचे मारले गेलेले कल्चर सामान्यतः 80 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 30 मिनिटे गरम करून किंवा वाहत्या वाफेवर उपचार करून मिळवले जातात. मारले गेलेले सूक्ष्मजंतू 0.15 M NaCl सह तीन वेळा धुतले जातात, पुन्हा निलंबित केले जातात आणि निलंबनाची एकाग्रता निर्धारित केली जाते.

बेकरचे यीस्ट तयार करणे: 0.5 ग्रॅम बेकरचे यीस्ट 0.15 M NaCl मध्ये निलंबित केले जाते आणि 30 मिनिटे उकळत्या पाण्याच्या बाथमध्ये ठेवले जाते. कापूस-गॉझ फिल्टरद्वारे फिल्टर करा. लाइव्ह यीस्ट वापरताना, 1.0% ग्लुकोजच्या व्यतिरिक्त ताजे पेशी (4-5-दिवसीय संस्कृती) ईगलच्या माध्यमात तीन वेळा धुतात. सामान्यतः 10 8 आणि 10 9 पेशी/ml चे सेल सस्पेंशन वापरले जाते. घटक C5 मधील दोष शोधण्यासाठी यीस्टचा वापर चाचणी कण म्हणून केला जातो.

पॉलिस्टीरिन कणांचे निलंबन वापरणे: 1.091 मायक्रॉन व्यासासह पॉलीस्टीरिन कणांचे 10% जलीय निलंबन तयार करा. 0.15 M NaCl आणि सेंट्रीफ्यूजमध्ये BSA चे 0.2% द्रावण 1 + 1 च्या प्रमाणात पातळ करा. 253 nm च्या तरंगलांबीवर, 1 µg/ml पॉलीस्टीरिन सस्पेंशन 1.17x10 -3 चे शोषण देते.

लिपोपोलिसॅकराइडचे निलंबन वापरणे - खनिज तेलामध्ये तेल लाल O: 2 ग्रॅम तेल लाल ओ हे 50 मिली डायसोडेसिल फॅथलेट (किंवा पेट्रोलियम जेली) पोर्सिलेन मोर्टारमध्ये ग्राउंड केले जाते. 500 ग्रॅम वर 20 मिनिटे सेंट्रीफ्यूज करा. डायऑक्सिनच्या 10 मिलीलीटरमध्ये 10 μg सुपरनाटंट अंश जोडा, 525 एनएमच्या तरंगलांबीवर ऑप्टिकल घनता मोजा. रूपांतरण घटक 0.92 आहे. दुस-या टप्प्यावर, 40 मिलीग्राम लिपोपॉलिसॅकेराइड (ई. कोलाई 0.26 बी6, इ.) 0.15 एम NaCl च्या 3 मिलीमध्ये विरघळले जाते. नंतर या मिश्रणात डायसोडेसिल सल्फेटमध्ये तेल लाल O चे 1 मिली द्रावण घाला, मिश्रण 90 सेकंदांसाठी थांबवा. निलंबन ताबडतोब वापरले जाते आणि गोठवले जाऊ शकते.

फॅगोसाइटोसिस प्रतिक्रिया करण्यासाठी, फॉर्मलिनाइज्ड एरिथ्रोसाइट्स चाचणी कण म्हणून वापरले जाऊ शकतात.

बॅक्टेरियाचे फागोसाइटोसिस, जीवाणूनाशक क्रियाकलाप

जिवंत जीवाणूंच्या निलंबनासह प्रयोग: 3-10 सूक्ष्मजंतू/फॅगोसाइटचे प्रमाण सहसा वापरले जाते. एकूण 2 मिली वॉल्यूममध्ये, 1x10 6 फॅगोसाइट्स 3x10 6 - 1x10 7 सूक्ष्मजंतूंसह मिसळले जातात. प्रॅक्टिसमध्ये, 1 मिलीलीटर फागोसाइट सस्पेंशनमध्ये 1 मिली बॅक्टेरियल सस्पेंशन जोडले जाते, ज्यामध्ये हेपरिनचे 8 आययू जोडले गेले होते. परस्परसंवादाची वेळ सहसा 30 मिनिटे असते, काही प्रकरणांमध्ये ती जास्त असते. उष्मायनानंतर, 0.5 मिली मिश्रण घ्या, हॅन्क्स सोल्युशनमध्ये जिलेटिनच्या 0.1% द्रावणात 1.5 मिली, 0 डिग्री सेल्सिअस पर्यंत थंड करा आणि 300 ग्रॅमवर ​​3-4 मिनिटे सेंट्रीफ्यूज करा. गाळापासून स्मीअर तयार केले जातात आणि पॅपेनहाइमनुसार डाग केले जातात. 200 पेशी पहा (शक्य असल्यास तीन वेळा). फॅगोसाइटोसिसची टक्केवारी मोजली जाते. पेशींमध्ये असलेल्या जीवाणूंच्या संख्येवर आधारित, फागोसाइटोसिस क्रियाकलाप निर्देशांक मोजला जातो: फॅगोसाइटोसेड बॅक्टेरियाची संख्या फॅगोसाइटिक पेशींच्या टक्केवारीने गुणाकार केली जाते; फॅगोसाइटोसिसची तीव्रता 1 ते 4 पर्यंतच्या संख्येद्वारे व्यक्त केली जाते.

ग्रेड 1: फॅगोसाइटोज्ड I-4 जीवाणू
ग्रेड 2: 5-7 जीवाणू फॅगोसाइटोज्ड
ग्रेड 3: 8-10 जीवाणू फॅगोसाइटोज्ड
ग्रेड 4: 10 पेक्षा जास्त जीवाणू प्रति सेल फॅगोसाइटोज्ड

जिवंत सूक्ष्मजंतूंच्या फॅगोसाइटोसिसची पातळी निर्धारित करताना, सेल पेलेट आणि सुपरनेटंट अंश स्वतंत्रपणे तपासले जातात. अभ्यास केलेल्या अपूर्णांकांपैकी 0.1 मिली घन पोषक माध्यमांवर चाळून जिवंत सूक्ष्मजंतूंची संख्या निश्चित केली जाते. 24 (48) तास उष्मायन करा. जिवाणूनाशक क्रियांची गणना करताना, असे गृहीत धरले जाते की एक वसाहत एक जिवंत सूक्ष्मजंतूशी संबंधित आहे.

जीवाणूनाशक क्रियाकलापांच्या लक्ष्यित अभ्यासासाठी, रुग्ण आणि निरोगी दात्यांच्या रक्ताची तपासणी प्रतिजैविक द्रावण (पेनिसिलिन आणि स्ट्रेप्टोमायसिन/मिली 5000 युनिट्स) शिवाय आणि त्याशिवाय केली जाते आणि बॅक्टेरियाचे नियंत्रण देखील केले जाते. नमुना रचना: 0.3 मिली हँक्स द्रावण + 0.1 मिली सामान्य सीरम 5 रक्तदात्यांकडून घेतलेले रक्त, +0.5 मिली ल्युकोसाइट सस्पेंशन (10 7 पेशी/मिली) +0.1 मिली मायक्रोबियल सस्पेंशन (10 6 सूक्ष्मजीव/मिली). प्रति नमुन्यात प्रतिजैविक द्रावण 0.02 मिली जोडले जाते. नमुने 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात उबवले जातात आणि 20 मिनिटे, 1.5 तास आणि 3 तासांनंतर सूक्ष्मजंतूंची संख्या निर्धारित केली जाते. हे करण्यासाठी, प्रत्येक नमुन्यातून 0.1 मिली घ्या, निवडलेल्या एलिकोट्सला हँक्स सोल्यूशनने 10, 100 आणि 1000 वेळा पातळ करा आणि गरम केलेल्या अगरला लावा. काहीवेळा, विशेषत: प्रतिजैविक जोडले गेले असल्यास, सूक्ष्मजंतू अचूकपणे मोजण्यासाठी इंटरमीडिएट डायल्युशन्स तयार केले जातात (उदाहरणार्थ, 0.2 मिली नमुना 5 मिली हॅन्क्स सोल्यूशनमध्ये मिसळला जातो, 450 ग्रॅमवर ​​5 मिनिटे सेंट्रीफ्यूज केला जातो, गाळ 1.9 मिली मध्ये विरघळला जातो. पीबीएस, आगर वर लागू). जर तुम्हाला बॅक्टेरियोलॉजिकल रिसर्चचा कालावधी कमी करायचा असेल, तर तुम्ही ऍक्रिडाइन यलो स्टेनिंगचा वापर करून फ्लोरोसेन्सद्वारे सेलमधील सूक्ष्मजंतू निर्धारित करू शकता.

बेकरच्या यीस्टचे फॅगोसाइटोसिस: 0.15 M NaCl मध्ये 10 9 पेशी/मिली निलंबन तयार करा. रुग्णाच्या प्लाझ्माच्या 0.1 मिली निलंबनात 0.1 मिली मिसळा, 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 30 मिनिटे उबवा, 0.2 मिली (10 6) पीएमएन घाला, 30 मिनिटे उष्मायन करा. अलिकोट्स 5 ते 30 मिनिटांच्या अंतराने काढले जातात. 100 PMN मोजले जातात आणि प्रति सेल कॅप्चर केलेल्या यीस्ट कणांची संख्या निर्धारित केली जाते. खालील बदल ज्ञात आहेत: 50 μl गिनी पिग सीरममध्ये 50 μl चाचणी सीरम (पूर्वी ग्लुकोजसह ईगलच्या माध्यमासह 1 + 1 च्या प्रमाणात पातळ केले गेले होते), 50-200 μl ल्युकोसाइट सस्पेंशन (10 7 पेशी) जोडा /ml) आणि ग्लुकोजसह मध्यम सुईने व्हॉल्यूम 450 μl वर समायोजित करा आणि 37 °C वर 30 मिनिटे उबवा. नंतर 50 µl यीस्ट सस्पेंशन (10 8 पेशी/मिली) घाला, मिक्स करा, 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 40 मिनिटे उबवा. 50 μl L-75 Se-methionine (एकूण क्रियाकलाप 100 kBq) घाला, मिक्स करा आणि 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 1 तास उबवा. पेशी 1000 ग्रॅम वर 5 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे प्रक्षेपित केल्या जातात, पीबीएसने दोनदा धुतल्या जातात आणि गामा काउंटरवर रेडिओएक्टिव्हिटी मोजली जाते. फॅगोसाइटोसेड यीस्टची टक्केवारी सूत्र वापरून मोजली जाते:

खनिज तेलामध्ये तेल लाल रंगाचे द्रावण वापरून फॅगोसाइटोसिस: 0.2 मिली कण सस्पेन्शन 0.8 मिली सेल सस्पेन्शनमध्ये मिसळले जाते, 37 डिग्री सेल्सियस पर्यंत गरम केले जाते. उष्मायनाच्या 5 मिनिटांनंतर, 126 μg/cl N-ethylmaleimide (कण पकडणे थांबवण्यासाठी) असलेले 0.15 M NaCl द्रावण 0°C वर थंड केलेले 6 मिली घाला. 250 ग्रॅम वर 10 मिनिटे सेंट्रीफ्यूज करा. सुपरनेटंट अंश टाकून दिला जातो, गाळ NaCl आणि N-ethylmaleimide (वर पहा) च्या द्रावणात पुन्हा लावला जातो आणि पेशी दोनदा धुतल्या जातात. पेशी अल्ट्रासाऊंडने लिस्ड केल्या जातात आणि तेल लाल सोडले जाते. डायऑक्सेन 1 मिली घाला. 500 ग्रॅम वर 15 मिनिटे सेंट्रीफ्यूज करा, शुद्ध डायऑक्सेनच्या विरूद्ध 525 एनएम लाटेवर ऑप्टिकल घनता मोजा. फॅगोसाइटोसिस (IF) ची डिग्री 10 7 पेशींद्वारे प्रति मिनिट शोषले जाणारे खनिज तेल (मिग्रॅ) म्हणून परिभाषित केले जाते. गणना करण्यासाठी, आपण खालील सूत्र वापरू शकता:

मॅक्रोफेजच्या मोनोलेयरमध्ये फॅगोसाइटोसिसचा अभ्यास:

1. टप्पा: 2 मिली सेल सस्पेंशन (200,000 पेशी/मिली) निर्जंतुकीकरण पॉलीस्टीरिन ट्यूबमध्ये घाला. 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 5 तास लसीकरण करा, नंतर ईगल माध्यमाने धुवा. 10% निष्क्रिय (30 मिनिटे, 56 °C) गर्भाच्या बोवाइन सीरमसह 2 मिली कल्चर माध्यम चाचणी ट्यूबमध्ये घाला आणि 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात उबवा.

2. फेज A: सूक्ष्मजंतूंचे निलंबन (3-10/मॅक्रोफेज) जोडा, 37 °C तापमानावर 30-60 मिनिटे उष्मायन करा, नॉन-फॅगोसाइटोज्ड सूक्ष्मजंतू काढून टाकण्यासाठी 3 मिली मध्यम भागाने ट्यूब 6 वेळा स्वच्छ धुवा. 1 भाग ग्लेशियल ऍसिटिक ऍसिड आणि 3 भाग मिथेनॉलच्या मिश्रणाने ताबडतोब तयारी निश्चित करा. मे-ग्रिनवाल्डच्या अनुसार तयारी डागली जाते, आणि पेशींची गणना केली जाते.

फेज बी: इंट्रासेल्युलर जिवंत जीवाणूंचे निर्धारण. ऑपरेशन्सचा क्रम फिक्सेशन स्टेजच्या आधी फेज ए प्रमाणेच आहे. धुतल्यानंतर, माध्यमाचे सर्व ट्रेस काळजीपूर्वक काढून टाकले जातात. 0.01% निर्जंतुक बोवाइन सीरम अल्ब्युमिन द्रावण (4°C) मध्ये 2 मिली जोडून आणि वारंवार हलवून पेशी नष्ट केल्या जातात. बहुतेक पेशी 20 मिनिटांनंतर नष्ट होतात. सोडलेले जीवाणू घन पोषक माध्यमांवर चाळणी करून निर्धारित केले जातात.

एरिथ्रोसाइट्सचे फॅगोसाइटोसिस: पीबीएसच्या 5 मिली मध्ये 4x10 7 फॅगोसाइट्स 5x10 7 चाचणी एरिथ्रोसाइट्ससह मिसळा. 0 डिग्री सेल्सिअस आणि सेंट्रीफ्यूजवर थंड झालेल्या 5 मिमी फॉस्फेट बफरमध्ये 2 मिली मिश्रण स्थानांतरित करा. सुपरनॅटंट अंशाची ऑप्टिकल घनता 420 एनएमच्या तरंगलांबीवर मोजली जाते. कॅलिब्रेशन वक्र वापरून सेल-फ्री टप्प्यात हिमोग्लोबिन सामग्रीमध्ये घट झाल्यामुळे फॅगोसाइटोसिसची डिग्री निर्धारित केली जाते.

क्लिअरन्स निश्चित करण्यासाठी सरलीकृत पद्धत

उंदरांमध्ये क्लिअरन्स निश्चित करण्याचे उदाहरण: प्राण्यांना प्रति 100 ग्रॅम वजनाच्या (0.1 मिली//100 ग्रॅम) 5x10 7 सूक्ष्मजंतूंनी इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन दिले जाते. इष्टतम डोस प्रति 100 ग्रॅम वजनाच्या 10 6 ते 10 8 पर्यंत असू शकतो. 1-2 तासांच्या अंतराने, प्रायोगिक प्राण्यांच्या प्रत्येक गटातील 3 व्यक्तींची कत्तल केली जाते; प्रयोगाचा एकूण कालावधी 16 तासांचा आहे. निर्जंतुकपणे हृदयातून 0.5 मिली रक्त, पेरीटोनियल द्रवपदार्थ 1 मिली आणि फुफ्फुसे, यकृत, प्लीहा आणि मूत्रपिंड वेगळे करा. पाश्चर पिपेट वापरून सिलिंडर अंगाच्या ऊतीमधून कापले जातात. सूक्ष्मजीवांची संख्या द्रव आणि घन पोषक माध्यमांवर लागवड करून निर्धारित केली जाते.

उंदरांमध्ये क्लिअरन्स निश्चित करण्याचे उदाहरण: कोलाइडल कार्बन किंवा 51 [Cr]-लेबल असलेली मेंढी एरिथ्रोसाइट्स वापरली जातात. उंदरांना (प्रयोगात किमान 5 प्राणी) 0.01 मिली कोळशाच्या निलंबनाने 16 मिलीग्राम प्रति 100 ग्रॅम वजनाच्या दराने इंट्राव्हेनस इंजेक्ट केले जाते. 15 मिनिटांच्या आत, 2 मिनिटांच्या अंतराने, रेट्रो-ऑर्बिटल स्पेसमधून 0.025 मिली रक्त घेतले जाते. निवडलेले 0.025 मिली रक्त 0.1% Na 2 C0 3 च्या 2.0 मिली द्रावणात जोडले जाते. हेमोलिसिसनंतर, कॅलिब्रेशन वक्र वापरून 675 एनएमच्या तरंगलांबीवर कार्बन एकाग्रता रंगमितीने निर्धारित केली जाते.

t - मिनिटांमध्ये वेळ, C - नमुन्यातील कार्बन एकाग्रता.

फॅगोसाइटोसिसचे योग्य मूल्य:

फागोसाइट्सची कार्यात्मक तपासणी

डिग्रेन्युलेशनचे निर्धारण (क्रियाकलापाचे मोजमाप (β-glucuropidase): 10 7 ल्युकोसाइट्स 0.8 मिली पीबीएसमध्ये प्लॅस्टिक ट्यूबमध्ये निलंबित केले जातात, 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 5 मिनिटे हलवले जातात. 0.2 मिली सेन्सिटाइज्ड एलपीएस, फ्लोरोक्रोम कण, (08 एफसी) जोडा. बर्फावर 30 मिनिटे थंड करा, 250 ग्रॅम वर 10 मिनिटे सेंट्रीफ्यूज करा. सुपरनेटंट अंशातील एन्झाइमची क्रिया तपासा. 0.9 मिली सब्सट्रेट मिश्रण 18 तासांसाठी 0.1 मिली चाचणी अंशासह उबवा. 0.1 एम NaOH मध्ये 2 मिली जोडा , तरंगलांबी 410 nm वर ऑप्टिकल घनता मोजा.

गणना:

(OD 410 x 20)/(1.84 x 18) = 1 तासात 10 7 ल्युकोसाइट्सद्वारे सोडलेल्या पदार्थाच्या nmoles ची संख्या, म्हणजेच, degranulation ची डिग्री paranitrophenyl-β-glucuronide च्या nanomoles मध्ये व्यक्त केली जाते.

मायलोपेरॉक्सीडेस दोष निर्धारित करण्याची पद्धत: एच 2 0 2 च्या जैवरासायनिक निर्धाराने सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त केले जातात, जे फॅगोसाइटोसिसच्या प्रक्रियेदरम्यान चयापचयातील बदल दर्शवितात. व्यावहारिक हेतूंसाठी, हेक्सोज-मोनोफॉस्फेट शंटचे सक्रियकरण, टेट्राझोलियम नायट्रोइन कमी करणे आणि पीएमएन प्रथिनांना एक्सोजेनस आयोडीनचे बंधन H 2 0 2 च्या निर्मितीशी संबंधित असणे खूप महत्वाचे आहे. अल्कोहोल आणि फॉर्मेलिनच्या मिश्रणासह 30 सेकंदांसाठी नियमित रक्त स्मीअर निश्चित केले जाते. डिस्टिल्ड पाण्याने धुवा आणि पेरोक्सिडेजसाठी 30 सेकंदांसाठी डाग ठेवा. पेरोक्सिडेज असलेल्या पेशींमध्ये, गडद निळ्या रंगाचे समावेश शोधले जातात.

टेट्राझोलियम नायट्रोब्ल्यू (TNB) कमी करण्यासाठी चाचणी. THC सामान्य PMN द्वारे फॉर्मझानमध्ये कमी केले जाते. 0.15 M NaCl मध्ये 0.1 ml 0.1% THC द्रावण 0.1 ml रक्तात मिसळा, 37 ° C वर 20 मिनिटे उष्मायन करा आणि पुन्हा चांगले मिसळा. पेशींमध्ये फॉर्मझानचा समावेश मायक्रोस्कोपीद्वारे निर्धारित केला जातो. परिणाम फॉर्मॅझन-पॉझिटिव्ह पेशींची टक्केवारी म्हणून व्यक्त केला जातो.

खालील पद्धत थोडी अधिक क्लिष्ट आहे: रुग्णाच्या रक्ताचा 1 थेंब कव्हरस्लिपवर लावला जातो. आर्द्र चेंबरमध्ये 37°C तापमानावर 20 मिनिटे उष्मायन करा, नंतर काच काळजीपूर्वक 0.15 M NaCl ने धुवा. स्लाईडवर एक कव्हर ग्लास ठेवा जिथे THC माध्यमाचा 1 थेंब लावला गेला होता (0.5 मिली सीरम + 0.3 मिली निर्जंतुक 0.15 M NaCl + 0.6 मिली THC, आधी पहा). आर्द्र चेंबरमध्ये 37 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 30 मिनिटे उष्मायन करा, कव्हरस्लिप काढून टाका आणि हवा कोरडी करा. 60 सेकंदांसाठी परिपूर्ण मिथेनॉलसह निराकरण करा आणि डिस्टिल्ड पाण्याने धुवा. safranin (1 ग्रॅम safranin + 100 ml डिस्टिल्ड वॉटर + 40 ml ग्लिसरीन) ने 5 मिनिटे डाग, धुवा. फॉर्मझान-पॉझिटिव्ह पेशी आकाराने मोठ्या असतात, स्फोट पेशींसारख्या असतात आणि त्यात निळे ग्रेन्युल असतात. सामान्यतः, तयारीमध्ये सुमारे 30% फॉर्मॅझन-पॉझिटिव्ह पेशी आढळतात.

फागोसाइटोसिसचे मूल्यांकन करण्यासाठी वरील पद्धती मोठ्या संख्येने प्रकाशनांचा सारांश दर्शवितात. या मुद्द्यांवर अधिक तपशीलवार माहिती संबंधित कामांमध्ये आढळू शकते.

फागोसाइटोसिस (ग्रीक phago - devour and cytos - cell मधून) ही सूक्ष्मजीवांसह प्रतिजैविक पदार्थांचे शोषण आणि पचन करण्याची प्रक्रिया आहे, ज्याला मेसोडर्मल उत्पत्तीच्या पेशी म्हणतात. फॅगोसाइट्स. I. I. मेकनिकोव्हने फागोसाइट्सचे विभाजन केले मॅक्रोफेजेस आणि मायक्रोफेजेस. सध्या, मॅक्रो- आणि मायक्रोफेजेस एकत्र केले जातात युनिफाइड मॅक्रोफेज सिस्टम (SMF). या प्रणालीमध्ये हे समाविष्ट आहे:

• टिश्यू मॅक्रोफेज - एपिथेलिओइड पेशी,
• स्टेलेट रेटिक्युलोएन्डोथेलियोसाइट्स (कुफ्फर पेशी),
• alveolar आणि peritoneal macrophages alveoli आणि peritoneal cavity मध्ये स्थित आहे,
• त्वचेची पांढरी प्रक्रिया एपिडर्मोसाइट्स (लॅन्गरहन्स पेशी), इ.

मायक्रोफेजमध्ये समाविष्ट आहे:

• न्यूट्रोफिल्स,
• इओसिनोफिल्स,
• बेसोफिल्स

मॅक्रोफेजची कार्येअत्यंत वैविध्यपूर्ण. परदेशी पदार्थावर प्रतिक्रिया देणारे ते पहिले आहेत, विशेष पेशी आहेत ज्या शरीरातील परदेशी पदार्थ शोषून घेतात आणि नष्ट करतात (मृत पेशी, कर्करोगाच्या पेशी, जीवाणू, विषाणू आणि इतर सूक्ष्मजीव, प्रतिजन, गैर-चयापचय अजैविक पदार्थ). याव्यतिरिक्त, मॅक्रोफेज अनेक जैविक दृष्ट्या सक्रिय पदार्थ तयार करतात - एन्झाईम्स (लायसोझाइम, पेरोक्सीडेस, एस्टेरेससह), पूरक प्रथिने, इंटरल्यूकिन्स सारख्या इम्युनोमोड्युलेटर. इम्युनोग्लोबुलिन (Am) साठी रिसेप्टर्सची उपस्थिती आणि मॅक्रोफेजच्या पृष्ठभागावर पूरक, तसेच मध्यस्थांची एक प्रणाली, टी- आणि बी-लिम्फोसाइट्ससह त्यांचे परस्परसंवाद सुनिश्चित करते. या प्रकरणात, मॅक्रोफेज टी-लिम्फोसाइट्सचे संरक्षणात्मक कार्य सक्रिय करतात. पूरक आणि Am, तसेच हिस्टोकॉम्पॅटिबिलिटी सिस्टम (HLA) च्या Ag साठी रिसेप्टर्सच्या उपस्थितीमुळे, मॅक्रोफेजेस प्रतिजनांच्या बंधनात आणि ओळखण्यात भाग घेतात. अशा प्रकारे, फागोसाइट्सची तीन कार्ये आहेत:

• संरक्षक, संसर्गजन्य एजंट, ऊतींचे क्षय उत्पादने इत्यादींच्या शरीराच्या शुद्धीकरणाशी संबंधित;
• प्रेझेंटिंग, लिम्फोसाइट्सच्या फॅगोसाइट झिल्लीवर ऍन्टीजेनिक एपिटोलच्या सादरीकरणामध्ये समावेश;
• सेक्रेटरी, लाइसोसोमल एंजाइम आणि इतर जैविक दृष्ट्या सक्रिय पदार्थांच्या स्रावशी संबंधित - साइटोकिन्स, जी इम्युनोजेनेसिसमध्ये महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावतात.

खालील क्रमिक प्रक्रिया ओळखल्या जातात: फागोसाइटोसिस स्टेज.

• केमोटॅक्सिस- वातावरणातील केमोएट्रॅक्टंट्सच्या रासायनिक ग्रेडियंटच्या दिशेने फागोसाइट्सची लक्ष्यित हालचाल. केमोटॅक्सिसची क्षमता केमोएट्रॅक्टंट्स (फॅगोसाइटोसिसच्या वस्तू) साठी विशिष्ट रिसेप्टर्सच्या पडद्यावरील उपस्थितीशी संबंधित आहे, जे जीवाणू, शरीराच्या ऊतींचे ऱ्हास करणारे उत्पादने इत्यादी असू शकतात.
• आसंजन(संलग्नक) देखील संबंधित रिसेप्टर्सद्वारे मध्यस्थी केली जाते, परंतु गैर-विशिष्ट भौतिक-रासायनिक परस्परसंवादाच्या नियमांनुसार पुढे जाऊ शकते. मॅक्रोफेजच्या पृष्ठभागावर कण शोषले जातात.
• एंडोसाइटोसिस(कॅप्चर) - सेल झिल्लीचे आक्रमण होते, परदेशी कण कॅप्चर होतो आणि प्रोटोप्लाझममध्ये त्याचे विसर्जन होते. एंडोसाइटोसिसच्या परिणामी, फागोसाइटिक व्हॅक्यूओल तयार होते - फागोसोम(म्हणजे, शोषलेल्या कणाभोवती प्रोटोप्लाझममधील बबल).
• इंट्रासेल्युलर पचन- फॅगोसाइटोज्ड वस्तू शोषल्यापासून सुरू होते. फॅगोसोम फॅगोसाइटच्या लाइसोसोममध्ये विलीन होतो, ज्यामध्ये डझनभर एंजाइम असतात आणि एन्झाईमद्वारे पकडलेल्या कणाचा फागोलिसोसोम (नाश) तयार होतो. जेव्हा जीवाशी संबंधित कण स्वतःच शोषला जातो (उदाहरणार्थ, मृत पेशी किंवा त्याचे भाग, स्वतःचे प्रथिने), ते फॅगोलिसोसोम एन्झाईम्सद्वारे गैर-अँटीजेनिक पदार्थांमध्ये (अमीनो ऍसिडस्, फॅटी ऍसिडस्, न्यूक्लियोटाइड्स, मोनोसॅकराइड्स) मध्ये मोडतात. जर एखादा परदेशी कण शोषला गेला असेल, तर फॅगोलिसोसोमचे एन्झाईम पदार्थाला नॉन-एंटीजेनिक घटकांमध्ये खंडित करू शकत नाहीत. अशा परिस्थितीत, प्रतिजनाचा उर्वरित भाग असलेला फॅगोलिसोसोम जो परकीय राहतो तो मॅक्रोफेजद्वारे टी- आणि बी-लिम्फोसाइट्समध्ये हस्तांतरित केला जातो, म्हणजेच, प्रतिकारशक्तीचा एक विशिष्ट दुवा चालू केला जातो.

सेक्रेटरी फंक्शनजैविक दृष्ट्या सक्रिय पदार्थांच्या फागोसाइट्सद्वारे स्राव मध्ये असतात - साइटोकिन्स - हे इंटरल्यूकिन -1 आणि इंटरल्यूकिन -2 आहेत, जे सेल्युलर मध्यस्थ आहेत ज्यांचा प्रसार, भेदभाव आणि फागोसाइट्स, लिम्फोसाइट्स, लिम्फोब्लास्ट्स आणि इतर पेशींच्या कार्यांवर नियामक प्रभाव पडतो. मॅक्रोफेजेस जैविक क्रियाकलापांच्या विस्तृत स्पेक्ट्रमसह प्रोस्टॅग्लॅंडिन्स, ल्युकोट्रिएन्स, चक्रीय न्यूक्लियोटाइड्स सारख्या महत्त्वपूर्ण नियामक घटकांची निर्मिती आणि स्राव करतात. याव्यतिरिक्त, मॅक्रोफेजेस अनेक उत्पादनांचे संश्लेषण आणि स्राव करतात ज्यात बॅक्टेरियाच्या वाढीस प्रतिबंध करणारा पदार्थ, अँटीव्हायरल आणि साइटोटॉक्सिक क्रियाकलाप असतो (ऑक्सिजन रॅडिकल्स O2-H2O2, लाइसोझाइम, इंटरफेरॉन इ.).

फागोसाइटोसिस हे ऑप्सोनिन ऍन्टीबॉडीज द्वारे वर्धित केले जाते, कारण या ऍन्टीबॉडीजच्या रिसेप्टर्सच्या उपस्थितीमुळे फागोसाइटच्या पृष्ठभागावर बांधलेले किंवा प्रतिजन अधिक सहजपणे शोषले जाते. ऍन्टीबॉडीजद्वारे फॅगोसाइटोसिसच्या या वाढीस म्हणतात opsonization, म्हणजे फागोसाइट्सद्वारे कॅप्चर करण्यासाठी सूक्ष्मजीव तयार करणे. Opsonized antigens च्या Phagocytosis ला रोगप्रतिकारक म्हणतात.

फॅगोसाइटोसिसची क्रिया वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी, फागोसाइटिक निर्देशक.हे निर्धारित करण्यासाठी, एका फागोसाइटद्वारे शोषलेल्या जीवाणूंची संख्या सूक्ष्मदर्शकाखाली मोजली जाते. देखील वापरले opsonophagocytic निर्देशांक, रोगप्रतिकारक आणि नॉन-इम्यून सीरमसह प्राप्त झालेल्या फागोसाइटिक निर्देशकांचे गुणोत्तर दर्शविते. रोग प्रतिकारशक्ती आणि रोगप्रतिकारक स्थितीचे मूल्यांकन करण्यासाठी क्लिनिकल इम्यूनोलॉजीमध्ये फॅगोसाइटिक इंडेक्स आणि ऑप्सोनोफॅगोसाइटिक इंडेक्स वापरले जातात.

फागोसाइटोसिस जीवाणूरोधी, अँटीफंगल आणि अँटीव्हायरल संरक्षणामध्ये महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावते, शरीराचा परदेशी पदार्थांचा प्रतिकार राखतो. फागोसाइट्सचा लिम्फोसाइट्सवर सक्रिय आणि दडपशाही प्रभाव देखील असतो, ते रोगप्रतिकारक सहिष्णुतेच्या पुनरुत्थानात भाग घेतात, संसर्गविरोधी, प्रत्यारोपण आणि अँटीट्यूमर प्रतिकारशक्ती आणि काही प्रकारच्या ऍलर्जी (एचआरटी) मध्ये भाग घेतात.