При обнаружении яиц гельминтов на различных объектах окру­жающей среды (почва, вода, овощи и др.) всегда необходимо опре­делять их жизнеспособность по внешнему виду, окрашиванием ви­тальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е.

Скармливанием лаборатор­ным животным.

Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при ма­лом, затем при большом увеличении. У деформированных и мерт­вых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плаз­ма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдви­нуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, ко­торые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней час­ти тела, по мере их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли - так называемые нитки жемчуга.

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власо­главов, остриц следует вызывать активные движения личинок лег­ким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жиз­неспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отсло­ившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце ли­чинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнару­живается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зер­нистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются ва­куоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина 0,5 г, натрия бикарбоната 0,09 г, дистиллированной воды 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36-38 “С на 4 ч. При этом живые зародыши осво­бождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также раство­ряются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6-8 ч в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1 % раствор натрия сульфида, или 20 % раствор натрия гипохлорида, или же в 1 % раствор хлорной воды при 36-38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 сут. Незрелые и мертвые он­косферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10 мин - 2 ч. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1 % раствора натрия хлорида, 0,5 % раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36- 38 °С.

Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при сла­бом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводко­вые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с лу­ночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроско­пом с нагревательным столиком при температуре 38-39 °С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные ско­лексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, уд­линяя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5-1 % водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежиз­неспособные сколексы при этом не вывертываются.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на расте­ниях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки тремато­ды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по распо­ложению крючьев на зародыше.

В живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятнико­образные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в сто­роны от средней пары.

Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться сначала от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.

В живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев распо­ложены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сбли­жены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом менее 45°.

Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздви­гает крючья. В погибшем зародыше движение крючьев прекраща­ется, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты под пря­мым, тупым или острым углом.

Иногда наблюдаются сморщивание зародыша, образование зер­нистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5-10 до 38-40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изу­чать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3 % раствор формалина, приготовленный на изотоническом раство­ре натрия хлорида при температуре 24-30 °С, яйца власоглавов в 3 % раствор соляной кислоты при температуре 30-35 °С, яйца ост­риц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37 “С. Чашки Петри следует открывать 1-3 раза в неделю для луч­шей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2-3 мес свиде­тельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гель­минтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых суток развивает­ся до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (вы­сотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из рав­ных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консис­тенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклян­ной трубки. В течение 1-2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25-30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личин­ки, а через 5-7 сут они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооружен­ным глазом. Естественно развивающиеся в воде яйца трематод, на­пример описторхов, дифиллоботриид, фасциол и др., помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают неболь­шой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол сле­дует учесть, что они быстрее развиваются в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22-24 °С через 9-12 сут формиру­ется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц тре­матод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. При культивирова­нии воду меняют через 2--3 сут.

Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26-30 °С в течение 5-6 сут личинки расползают­ся по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюллеборна).

Метод Harada и Mori (1955). В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой бе­рут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровально# бумаге (15X150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накры­вают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На про­бирке пишут номер и фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят в течение 8-10 сут при температуре 28 °С. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу филь­тровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под повер­хность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а оса­док переносят на предметное стекло, накрывают покровным стек­лом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок не­обходимо пользоваться данными, представленными в табл. 13.

Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов. Мертвые тка­ни в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем жи­вые. Эти особенности используют в гельминтологии для определе­ния жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдель­ных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Таблица 13. Дифференциальная диагностика филярневидных личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для дифференциального распознавания живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцируют метиле­новый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый си­ний в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают, зародыши мертвых яиц окрашива­ются в синий цвет.

Метод окрашивания неприменим для незрелых яиц аскарид и власоглавов; пигментированная оболочка прокрашивается, и поэтому не видно, окрасилась ли зародышевая клетка внутри яйца.

Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10 ООО осуществля­ют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жид­кости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Пре­парат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости, после чего этот же препарат просмат­ривают повторно через 2-3 ч. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 ч. Мертвые ли­чинки окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полно­стью).

Указывается на возможность окраски препаратов раствором йода при определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц. В ка­честве красителя в этом случае используют 5 % спиртовой раствор йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аска­ридий в течение 1-3 с окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторха и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раство­ром толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10 000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают сафранином (в разведе­нии 1:10 000 10 % раствора спирта). Спирт удаляет краску с оболо­чек, а сафранин придает им красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет, зародыш у мертвых - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином либо в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000 или же индигокармином в разведении 1:1000-1:2000.

Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2-7 ч.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня ре­комендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезиловый синий (1:8000) - через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окра­шивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бес­цветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 - в течение 3-5 ч; 3) 50 % ра­створ пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 ч при температуре 29-30 “С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокраши­ваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5-20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно дос­таточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообраз­но применять метиленовый синий для окрашивания мертвых пле­роцеркоидов.

Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жиз­неспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в каче­стве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивиро­вании плесневого гриба Peniciliium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.

Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежиз­неспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкило­стомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид - красный. Менее яр­кая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый цвет: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.

Физико-химические методы стимуляции выхода мирацвдия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физико­химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздей­ствием на яйца трематоды специальной реакционной среды в соче­тании с последовательными приемами - созданием перепада тем­ператур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.

Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предвари­тельно охлаждают до 10-12 °С. Все последующие операции осуще­ствляют при комнатной температуре (18-22 °С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержа­щей 100-400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5-10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осто­рожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробир­ку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного све­тового микроскопа (Х200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка актив­но выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3-5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красите­лем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчи­тывают мирацидии.

Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 М трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0-9,5. В буфер добавля­ют этанол до 10-13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работаю­щий в щелочных пределах pH, например 0,05 М фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол - 12 частей; краситель (маточный раствор) - 1-10 частей; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей - 0,05 М трис-HCl буфер, pH 9,5.

Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Гер­ман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц тре­матоды, помещают в центрифужную пробирку на 1-2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипет­кой 1-2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28-30 °С 2-3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на пред­метное стекло и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (18-22 °С), при этом каждые 25-30 мин (по мере подсыхания) до­бавляют по 1-2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллиро­ванной воде. После этого препарат микроскопируют при 100-200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу рас­крывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3-7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30-40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5-0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1- 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05-0,4 %) обусловли­вает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких про­зрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окраши­вания и подсчета мирацидиев.

Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов.

Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены в 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференциро­вать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюо­ресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стекла­ми; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.

Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гель­минтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц обо­лочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболоч­ка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевым в разведении 1:10 ООО и 1: 50 ООО от 30 мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки ост­риц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают туск­лый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином - у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от ли­лово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминес­цируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки строн­гилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мерт­вые - ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке ра­створами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюорохромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яр­кое свечение.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресни­чек, но спустя 10-15 мин после гибели проявляются ярким «горя­щим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.

Прямые методы: выявление самих гельминтов, их фрагментов, яиц, личинок в фекалиях, моче, дуоденальном секрете, мокроте, носовой и влагалищной слизи, содержимом подногтевых пространств, биопсированных кусочках ткани.

При диагностике нельзя каким-либо одним методом выявить яйца или личинки всех видов гельминтов, обитающих в пищеварительной системе человека. Так, при использовании метода флотации в поверхностную пленку не всплывают (из-за высокого удельного веса) яйца трематод, в некоторых случаях неоплодотворенные яйца аскарид. В кале очень редко можно обнаружить яйца остриц, онкосферы тениид, которые выявляются специальными методами исследований: соскоб с перианальных складок для остриц и тениид, методы осаждения для трематод (яйца описторха и др.). Поэтому для целенаправленного обследования больного на гельминтозы врач в направлении должен указать, на какие гельминты следует обратить основное внимание (диагноз), что позволит лаборанту выбрать соответствующую методику для выявления данного вида гельминта. Фекалии, взятые из разных мест испражнений в количестве не менее 50 граммов (чайная ложка) в чистую стеклянную посуду, должны быть отправлены в лабораторию не позднее чем через сутки после дефекации и исследованы в день поступления.

В случае необходимости сохранения кала до следующего дня его помещают в холодное место (0-4°С) или заливают одним из консервантов.

Перед исследованием кал перемешивают палочкой, чтобы яйца гельминтов оказались равномерно распределенными в общей массе.

При обнаружении в препарате яиц какого-либо гельминта просмотр не прекращают, т.к. может быть двойная или тройная инвазия.

Контроль за эффективностью лечения гельминтозов осуществляется путем исследования фекалий на яйца гельминтов через 2-3 недели или через 2-3 месяца после лечения в зависимости от обнаруженного гельминта.

Макроскопические методы служат для обнаружения в кале целых половозрелых гельминтов или их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы.

Часто на поверхности кала после дефекации можно видеть активно ползающих остриц; выделяются с калом аскариды; иногда люди сами замечают отхождение гельминтов. У больных дифиллоботриозом могут выделяться обрывки стробилы лентеца (в виде "лапши"), а у инвазированных тениидами (свиной или бычий цепень) с калом часто отходят членики гельминтов (в виде "белых обсечек") или они активно выползают из анального отверстия.

Макроскопический метод является основным для дифференциальной диагностики тениидоза и тениаринхоза (в сочетании с опросом).

Из специальных макроскопических методов применяется метод последовательного промывания фекалий.

Фекалии размешиваются в воде для получения равномерной суспензии, после чего при хорошем освещении их тщательно просматривают отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или на темном фоне в чашках Петри. Пинцетом или препаровальной иглой извлекают все подозрительные белые частицы, крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, и рассматривают их под лупой между двумя предметными стеклами. Мелких гельминтов или головки цестод рассматривают под лупой в капле глицерина или под микроскопом.

При использовании этого метода для диагностики члеников свиного, бычьего цепней, широкого лентеца отмытые членики помещают между двумя стеклами и, просматривая на свет под лупой или малым увеличением микроскопа, определяют видовую принадлежность по строению матки (у зрелого членика свиного цепня от центрального ствола отходят 8-12 боковых ответвлений, а у бычьего цепня 18-32, чаще 28-32, у широкого лентеца членики больше в ширину и матка в центре в виде "розетки"). Если матку плохо видно, то ее предварительно можно подержать некоторое время в 50% растворе глицерина, после чего даже запустевшие стволы матки просматриваются хорошо.

При определении этих цестод по строению отошедших головок их с шейкой осторожно кладут в каплю глицерина между предметными стеклами (или покрывают покровным стеклом) и, не передавливая, рассматривают под микроскопом при малом увеличении.

Микроскопические методы подразделяются на простые, сложные и специальные.

К простым относятся методы нативного мазка, нативный мазок раствором Люголя, методы толстого мазка под целлофаном по Като, закручивания (по Шульману) и перианального соскоба.

Сложные методы являются более эффективными и основаны на концентрации яиц в препаратах. Они включают в себя предварительную обработку фекалий жидкими реактивами, в результате чего яйца гельминтов или выпадают в осадок, или всплывают на поверхность жидкости.

К сложным методам относятся методы обогащения:

а) флотационные (когда удельный вес яиц меньше удельного веса солевого раствора и яйца всплывают в поверхностную пленку);

б) седиментационные (когда удльный вес яиц больше удельного веса солевых растворов и яйца оседают в осадок).

Специальными методами обнаружения яиц и личинок гельминтов, цист и вегетативных форм простейших являются методы соскоба, флотации, седиментации, ларвоскопии, протозооскопии, исследование желчи и методы окраски мазков кала, мокроты и др.

Простые методы исследования фекалий

Нативный мазок . Небольшую частицу испражнений берут деревянной палочкой из различных участков доставленной порции, хорошо растирают на предметном стекле в капле 50%-ного раствора глицерина и делают на 2-3 предметных стеклах тонкий мазок. Просматривают под микроскопом не менее 3 препаратов. Недостаток метода: просматривается малое количество материала, поэтому как самостоятельный метод не применяется.

Метод закручивания (Шульмана). 2,0-3,0 г испражнений кладут в стаканчик, тщательно размешивают стеклянной палочкой с 5-кратным объемом физиологического раствора или дистиллированной воды, производя быстрые движения в течение 2-3 мин, и быстро вынимают палочку из смеси. Каплю смеси на конце палочки переносят на предметное стекло и микроскопируют. Принцип центробежной силы вызывает скопление яиц и личинок на палочке.

Метод толстого мазка по Като с целлофаном . Химические реактивы:100%-ный глицерин, 6%-ный раствор фенола (100 мл воды + 6 г фенола), 3%-ный раствор малахитовой зелени (2,5 мл дистиллированной воды + 75 мл малахитовой зелени).

Приготовление рабочего раствора: 100 мл 6%-ного раствора фенола + 100 мл чистого глицерина + 1,2 мл 3%-ного раствора малахитовой зелени.

Приготовление целлофановых полосок: нарезаются полоски из целлофана, размер которых соответствует предметному стеклу. Целлофан должен быть гидрофильный (пригоден целлофан, который горит; если плавится, то непригоден). В рабочем растворе можно обработать до 5 тыс. полосок. Срок экспозиции целлофановых полосок до готовности к употреблению в рабочем растворе не менее 24 час.

Ход исследования. На предметное стекло наносят 50 мг фекалий (с крупную горошину), растирают индивидуальной палочкой (стеклянной, деревянной), накрывают целлофановой полоской и сверху притирают резиновой пробкой до получения равномерного толстого мазка. Препарат высушивают при комнатной температуре в течение часа или в термостате при 40°С в течение 20-30 мин и микроскопируют (время выдержки можно увеличить при комнатной температуре до 5-6 час и более).

По эффективности данный метод приближается к методу флотации, но выявляет инвазию интенсивную и средней интенсивности.

Применяется как самостоятельный метод диагностики и рекомендуется для массового обследования населения.

В клинико-диагностических лабораториях применяется как унифицированный метод диагностики гельминтов при отсутствии в направлениях врачей конкретных диагнозов.

Методы перианального соскоба и нативного мазка с раствором Люголя описаны в разделе специальных методов.

Сложные методы обогащения фекалий

В основу методов обогащения положена разность удельного веса яиц гельминтов и применяемого солевого раствора.

При применении метода флотации могут быть использованы следующие солевые растворы:

1. Раствор нитрата свинца PbNO3 (азотнокислого свинца) с плотностью 1,5. Готовится из расчета 650 г вещества на 1 л воды. Соль растворяют порциями в горячей воде в эмалированной посуде, подогревая на плите и постоянно помешивая до полного растворения. Фильтровать раствор не обязательно. Раствор готовят в день исследования, так как со временем он дает осадок, и плотность его начинает падать уже через 24 ч. Если раствор приготовлен в большом количестве, то в последующие дни перед исследованием его подогревают, размешивая осадок. Приготовление раствора производится в вытяжном шкафу, так как нитрат свинца – соль тяжелого металла.

2. Раствор нитрата аммония NH4NO3 (гранулированной или обычной аммиачной селитры) с плотностью 1,3 готовят так же, как и предыдущий, но из расчета 1500 г вещества на 1 л горячей воды.

3.Раствор нитрата натрия NaNO3 или азотнокислого натрия с плотностью 1,38-1,4 готовят из расчета 1000 г вещества на 1 литр горячей воды.

4. Раствор тиосульфата натрия Na2S2O3×5H2O (гипосульфита натрия) с плотностью 1,4 готовят из расчета 1750 г вещества на 1 л горячей воды.

5. Раствор сульфата натрия Na2SO4 (английской соли) с плотностью 1,26-1,28 готовят из расчета 920 г вещества на 1 л горячей воды.

6. Раствор хлорида цинка ZnCl2 (хлористого цинка) с плотностью 1,82 готовят из расчета 2000 г вещества на 1 л горячей воды. Остывший раствор не кристаллизуется.

7. Насыщенный раствор хлорида натрия NaCl (поваренная соль) с плотностью 1,18-1,2. На! л воды добавляют 400-420 г соли порциями в эмалированное ведро с кипящей водой, постоянно размешивая до полного растворения. При остывании раствора выпадают кристаллы хлорида натрия.

Удельный вес флотационных растворов измеряется аэрометром только после полного остывания раствора при комнатной температуре.

Методы флотации наиболее эффективны для обнаружения яиц карликового цепня, власоглава, анкилостомид, аскарид, широкого лентеца.

Поверхностную пленку можно снимать с помощью проволочной петли или предметного стекла.

В насыщенном растворе поваренной соли пленку можно исследовать через 30-40 мин, в растворе аммиачной селитры – через 10-20-30 мин после отстаивания.

При снятии пленки проволочной петлей исследуют не менее 8 капель.

Предметные стекла снимают с пленки больше яиц, чем проволочные петли. Стекло должно соприкасаться с жидкостью флотационного раствора, которую добавляют в стаканчик пипеткой. После отстаивания стекло снимают, кладут смоченной поверхностью вверх на стекло большего размера и исследуют под микроскопом. Предметные стекла перед использованием обязательно обезжиривают.

Для проведения исследований необходимо иметь: предметные стекла, химические стаканчики, проволочные петли, кюветы, чашки Петри, пипетки, груши, стеклянные или деревянные палочки.

Ход исследования. 5 г фекалий заливают 10-кратным количеством флотационного раствора (лучше удельным весом 1,38-1,40), тщательно размешивают, снимают сверху не растворяющиеся крупные частицы и оставляют взвесь на 10-15 мин. Затем пленку снимают либо петлей на предметное стекло, либо предметным стеклом. Для разведения испражнений лучше взять стаканчики емкостью 30-50 мл, налить раствор вровень с краями (или недоливать 2-3 мм) и смесь покрыть предметным стеклом, а затем пипеткой добавить флотационный раствор до его соприкосновения с предметным стеклом. Через 10-20 мин стекло быстро снять и оставшуюся на нем пленку микроскопировать без покровного стекла.

Методы осаждения-седиментации

Методы седиментации применяются для выявления в кале яиц геогельминтов, биогельминтов и как специальные методы исследования на описторхоз.

Метод Горячева-Золотухина (упрощенный метод Горячева). Около 1,5 г кала размешивают в химическом стаканчике в 3-4 мл воды. Полученную взвесь фильтруют через два слоя марли в центрифужную пробирку, наслаивая осторожно сверху на имеющиеся в ней 4-5 мл насыщенного раствора поваренной соли. Пробирки ставят в штатив на 15-20 ч. За это время тяжелые яйца трематод оседают. Получают два четко разграниченных слоя. Осадок микроскопируют.

Эфир-формалиновый метод. Применяется для диагностики всех кишечных инвазий и как специальный метод на простейшие и яйца описторхов.

Оборудование: центрифуга на 3000 об/мин; центрифужные градуированные пробирки, воронки; металлическое ситечко (чайное) или двухслойный бинт; предметные и покровные стекла; деревянные (или стеклянные) палочки; вата, бинт.

Химреактивы: 10%-ный раствор формалина (1 часть раствора формалина аптечного и 4 части дистиллированной воды); этиловый эфир (медицинский).

В центрифужные пробирки наливают 7 мл 10%-ного раствора формалина и помещают 1 г фекалий (такое количество фекалий, чтобы раствор в пробирке поднялся до 8 мл). Фекалии смешивают с формалином до образования однородной смеси, а затем через металлическое ситечко (или двухслойную марлю, бинт) переливают в другую центрифужную пробирку (если на ситечке остались фекалии, то ситечко надо ополоснуть формалином). Добавить 2 мл эфира в эту центрифужную пробирку, закрыть пробкой и энергично встряхивать в течение 30 сек.

Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение одной минуты (можно в течение двух минут при 1500 об/мин). За счет реакции эфир-формалина происходит коагуляция белков в виде пробки вверху пробирки, а в осадок выпадают яйца гельминтов. Слой коагулянта убирают, сливается надосадочная жидкость, осадок наносится на предметное стекло прямо из пробирки или пастеровской пипеткой, накрывается покровным стеклом и просматривается под микроскопом.

Метод эфир-уксусного осаждения . Принцип эфир-уксусного осаждения яиц гельминтов заключается в последовательной обработке проб фекалий 10%-ным водным раствором уксусной кислоты и эфиром. Уксусная кислота лучше других химических соединений эмульгирует пробу фекалий. Она проникает в непереваренные частицы, состоящие преимущественно из клетчатки, которые при большом содержании мешают исследованиям, выпадая в осадок после центрифугирования. Последующее добавление в пробирку эфира и перемешивание приводит к извлечению из содержимого пробирки уксусной кислоты вместе с пропитанными ею каловыми частицами. Так как удельный вес смеси эфира с уксусной кислотой меньше удельного веса воды, пробы кала, обработанные этими веществами, всплывают, а яйца гельминтов, обладающие большим удельным весом, оседают.

Количество осадка, полученного после эфир-уксусного осаждения, в 3-4 раза меньше, чем после эфир-формалинового. Это значительно облегчает обнаружение в нем яиц гельминтов и позволяет исследовать осадок целиком при навеске в 0,5-1 г. Токсичность эфир-уксусного метода в 5 раз ниже.

Ход исследования. В градуированную центрифужную пробирку наливают 7 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и вносят навеску кала 1 г (т.е. такое количество кала, при котором раствор уксусной кислоты поднимается до 8 мл). Тщательно размешивают стеклянной или деревянной палочкой. Процеживают через воронку с двумя слоями марли в другую центрифужную пробирку. К эмульгату добавляют 2 мл этилового эфира (т.е. до 10 мл). Пробирки закрывают резиновой пробкой (можно от пенициллинового флакона) и встряхивают 15 сек. Убрав пробку, пробирки центрифугируют в течение одной минуты при 3000 об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость из пробирки сливают. В некоторых случаях образовавшаяся каловая пробка мешает сливу надосадочной жидкости. В этом случае стеклянной или деревянной палочкой отделяют пробку от стенок пробирки. Осадок пипеткой целиком переносят на предметное стекло и микроскопируют под покровным стеклом при малом увеличении. Осадок, как правило, небольшой, бесцветный. Яйца гельминтов, особенно мелкие яйца трематод, хорошо обнаруживаются.

Химико-седиментационный метод . Принцип исследования основывается на осаждении яиц из пробы фекалий в солевом растворе с удельным весом 1,15. Сущность метода заключается в непосредственном центрифугировании пробирки, в которой на раствор азотнокислого натрия (уд. вес 1,16) наслоена пробка кала, эмульгированная в 1%-ном растворе уксусной кислоты. Высокий удельный вес солевого раствора и выделяемые за счет химической реакции пузырьки, пронизывающие слой гомогенизированного кала, препятствуют его осаждению. Яйца гельминтов выпадают в осадок с небольшим количеством клетчатки. Осадок можно очистить от оставшегося детрита, обработав его 10%-ным раствором уксусной кислоты и эфиром. В этом случае остаются только одни яйца гельминтов, что значительно облегчает их выявление.

Ход исследования. В градуированную центрифужную пробирку наливают 6 мл раствора азотнокислого натрия с удельным весом 1,15. В другую пробирку наливают 7 мл 1%-ного раствора уксусной кислоты. Вносят пробу фекалий (до метки 7,5 мл при пробе 0,5 г и до 8 мл при пробе в 1,0 г). Тщательно перемешивают пробу стеклянной палочкой. Процеживают через воронку с одним слоем марли, наслаивая на раствор азотнокислого натрия. Пробирку с наслоенным фильтратом центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 5 мин. Быстрым переворачиванием пробирки сливают надосадочную жидкость. В пробирку с осадком добавляют 3-4 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и 0,5 мл эфира, закрывают резиновой пробкой и встряхивают. Проводят повторное центрифугирование в течение 1 мин. Сливают надосадочную жидкость. Осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.

ГЕЛЬМИНТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖЕЛЧИ, ДУОДЕНАЛЬНОГО СОДЕРЖИМОГО, МОКРОТЫ, КРОВИ, МОЧИ И МЫШЦ

Обнаружение яиц и личинок гельминтов в дуоденальном содержимом и желчи. Исследование желчи и дуоденального содержимого производится при подозрении на гельминтозы печени и желчного пузыря (описторхоз, клонорхоз, дикроцелиоз) и двенадцатиперстной кишки (стронгилоидоз).

Ход исследования. Дуоденальное содержимое и желчь (порции А, В, С) получают обычным путем при помощи зондирования. Для порции В рекомендуется обязательно получать рефлекс желчного пузыря введением через зонд 33% раствора сернокислой магнезии. Из исследуемой жидкости выбирают и просматривают под микроскопом плавающие в ней хлопья, а затем смешивают ее с равным количеством серного эфира. Смесь тщательно взбалтывают и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а весь осадок исследуют под микроскопом.

При отсутствии гноя и слизи желчь и дуоденальное содержимое центрифугируют, не смешивая с эфиром.

Исследование мокроты. В гельминтологической практике исследование мокроты проводится с целью лабораторной диагностики парагонимоза. Иногда при этом выявляются яйца шистосом, личинки аскариды, элементы эхинококкового пузыря.

Из мокроты готовят нативный мазок на предметном стекле, который исследуют под микроскопом.

При обильном содержании в мокроте гноя ее смешивают с 0,5% раствором едкого натра или едкого калия, встряхивают в течение 5 минут и центрифугируют. Осадок микроскопируют.

Исследование крови. Кровь исследуют при подозрении на наличие у больного филяриозов.

В связи с тем, что при некоторых видах филяриозов (лоаоз, вухерериоз, вызванный субпериодическим штаммом) личинки (микрофилярии) бывают в периферической крови только днем, а при некоторых (бругиоз, вухерериоз, вызванный периодическим штаммом) – только ночью, соответственно в это время берут кровь для анализа.

Техника забора крови, приготовления препаратов (тонкий мазок и толстая капля), их окрашивания (по Романовскому) и исследование аналогичны таковым при лабораторной диагностике малярии.

Микрофилярии разных видов отличают по длине, ширине, изгибу тела, наличию или отсутствию чехлика, форме хвостового конца, расположению ядерной субстанции в теле и хвостовом отделе личинок.

Ход исследования. Мочу отстаивают не менее 30 мин, затем верхний слой сливают, оставляя 10-15 мл осадка, которые разливают в центрифужные пробирки, и центрифугируют в течение 1-2 мин. Слив надосадочную жидкость, осадок переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом.

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОПТАТОВ МЫШЦ

Метод трихинеллоскопии . Необходимость в исследовании биоптатов мышц больного возникает при подозрении на трихинеллез.

Биопсия проводится по общим правилам. Обычно делают биопсию дельтовидной мышцы. При паталогоанатомическом исследовании можно делать биопсию мышц диафрагмы, пищевода, языка, жевательных и межреберных мышц, сгибателей конечностей, мышц глазного яблока, так как они наиболее интенсивно поражаются личинками трихинелл.

В лаборатории биопсированный кусочек мышц разрезают на очень мелкие кусочки (микротомом), которые помещают между двумя стеклами, раздавливая мышечные волокна, и исследуют под микроскопом. В настоящее время для этой цели широко используются специальные микроскопы – трихинеллоскопы.

В случае трихинеллеза при трихинеллоскопии по ходу мышечных волокон обнаруживаются резко выделяющиеся овальной формы (похожие на лимон) трихинеллезные капсулы. Средняя величина капсул у человека составляет 0,4 х 0,26 мм. В капсуле, как правило, содержится одна спирально свернутая в 2,5 оборота трихинелла. При высокой интенсивности инвазии в одной капсуле может быть 2 или 3 личинки. Смежные с капсулой мышечные волокна теряют свою поперечную исчерченность и принимают гомогенный вид.

Таким же способом исследуют мясо или мясные продукты, явившиеся причиной заражения.

Метод переваривания мышц . Метод более эффективен.

Ход исследования. Исследуемые мышцы мелко измельчают и заливают искусственным желудочным соком в соотношении 1:15-20. Полученную смесь помещают в термостат при 37°С на 12-16 ч. По истечении этого срока микроскопируют осадок, в котором среди массы остатков переваренных мышечных волокон обнаруживаются личинки трихинелл в свободном состоянии.

Искусственный желудочный сок можно приобрести в аптеке или приготовить в лаборатории. Для этого к 1 л дистиллированной воды добавляют 10 мл концентрированной хлористоводородной кислоты; перед использованием к 1 л разведенной кислоты добавляют 30 г пепсина.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Количественные методы исследования применяются при определении интенсивности инвазии, оценке эффективности различных антигельминтных препаратов, определении качества дегельминтизации, контроле проводимых массовых лечебно-профилактических мероприятий и др.

Количественное определение яиц гельминтов проводится двумя методами: методом Столла и методом Красильникова и Волковой (1974).

Метод Столла . Для проведения исследования необходимо иметь микроскоп, стеклянную колбу с отметкой 56 и 60 мл, мерный цилиндр, стеклянные бусы, резиновую пробку для колбы, градуированные пипетки, предметные стекла и 0,4% раствор едкого натра.

Ход исследования. В колбу мерным цилиндром наливают децинормальный раствор едкого натра (примерно 0,4% концентрации) до метки 56 мл и добавляют испражнения до тех пор, пока уровень жидкости не достигнет отметки 60 мл (т.е. 4 мл испражнений). Смесь тщательно взбалтывают со стеклянными бусами в течение 1 минуты, закрыв сосуд резиновой пробкой (можно перемешать и палочкой). Тотчас после взбалтывания набирают градуированной пипеткой 0,075 мл смеси (в ней содержится 0,005 мл испражнений), переносят на предметное стекло и подсчитывают количество яиц в препарате под микроскопом. Чтобы определить количество яиц в 1 г испражнений, обнаруженное число умножают на 200.

Сравнение числа яиц в препарате, обнаруженное у больного до проведения лечения и после него позволяет судить об эффективности дегельминтизации.

Метод Столла прост, дает сравнимые результаты при всех гельминтозах, возбудители которых систематически выделяют яйца в кишечник больного. Однако недостатком метода является его относительно низкая чувствительность, особенно при слабой интенсивности инвазии.

Метод Красильникова-Волковой . При исследовании этим методом не менее 1 г фекалий смешивают в стеклянной колбочке или большой пробирке с 1% раствором "Лотоса" (или 1,5% раствором "Экстры") в соотношении 1:10. Взвесь тщательно взбалтывают до образования гомогенной суспензии, затем быстро набирают градуированной пипеткой 0,1 мл взвеси (что равняется 0,01 г фекалий) и переносят на предметное стекло. Препарат покрывают покровным стеклом или целлофановой пластинкой (20 х 30 мм), выдержанной не менее одних суток в 50% водном растворе глицерина.

Подсчитывают число яиц во всем препарате. Для расчета количества яиц в 1 г фекалий полученное число надо умножить на 100.

Этот метод имеет ряд преимуществ перед методом Столла. Во-первых, он более чувствителен и позволяет выявлять гельминтов при слабой степени инвазии. Во-вторых, он очень удобен при массовых обследованиях, так как растворы детергентов, являясь консервантами яиц гельминтов, позволяют проводить исследования и не совсем свежего материала. Однако обязательным условием при этом является сбор фекалий непосредственно в раствор детергента.

Для количественного исследования можно применять любой из описанных унифицированных качественных методов, основанных на принципе всплывания яиц. Но в этом случае для анализа должно быть взято одно и то же количество фекалий, один и тот же объем флотационного раствора. Расчет степени инвазии можно произвести, зная количество яиц в 1 г фекалий, по приведенной таблице.

Интенсивность инвазии в зависимости от числа яиц гельминтов

в 1 г фекалий

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

Эти методы, основанные на выявлении специфических антител в сыворотке крови, применяются с диагностической и скрининговой целями.

К серологическим методам относятся:

Реакция кольцепреципитации (РКП) (трихинеллез, цистицеркоз);

Реакция кольцепреципитации в пробирках на холоде (трихинеллез, цистицеркоз);

Реакция микропреципитации на живых личинках (трихинеллез, аскаридоз);

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) (трихинеллез, эхинококкоз, альвеококкоз, цистицеркоз и др.);

Реакция агглютинации латекса (РАЛ) (эхинококкоз, альвеококкоз, трихинеллез, тениаринхоз и др.);

Реакция связывания комплемента (РСК) (трихинеллез, эхинококкоз, цистицеркоз);

Реакция энзим-меченных антител (РЭМА) (эхинококкоз, онхоцеркоз, шистосомозы, трихинеллез, токсокароз);

Иммуноферментный анализ (ИФА) (трихинеллез, описторхоз, токсокароз, токсоплазмоз и др.).

Для постановки серологических реакций выпускаются стандартные антигены или же они готовятся самостоятельно (например, из эхинококковых пузырей овец), выпускаются специальные тест-системы для ИФА.

Специальные методы исследования на энтеробиоз, тениаринхоз, тениоз

Соскоб с перианальных складок . Для получения соскоба с перианальных складок можно применять деревянный шпатель, целлофановую полоску, целлюлозную бумагу или ленту, глазные палочки со специальным клеевым слоем:

а) соскоб деревянным шпателем (шпатель – уплощенная спичка или палочка), смоченным 1% раствором глицерина (или 0,5% раствором питьевой соды), производится легким соскабливанием с поверхности перианальных складок по всей окружности анального отверстия. Полученный соскоб переносят краем покровного стекла с конца шпателя на предметное стекло в каплю 50% раствора глицерина, накрывают этим же покровным стеклом и микроскопируют. Недостатком метода является недостаточная выявляемость яиц и раздражающее действие;

б) по методу Торгушина делают смыв ватным тампоном на деревянном или другом шпателе, смоченном 50% раствором глицерина, и готовят мазок на предметном стекле в капле глицерина;

в) по методу Кеворковой в центрифужную пробирку наливают около 5 мл кипяченой воды, помещают в него шпатель (палочку) с ватным тампоном. Перед взятием материала тампон слегка отжимают о внутреннюю стенку пробирки, обтирают им перианальные складки и вкладывают шпатель с тампоном в пробирку. Тщательно взбалтывают тампон в пробирке, смыв центрифугируют 3 мин и полученный осадок исследуют под микроскопом;

г) соскоб липкой лентой по Грэхэм. Часть липкой ленты (прозрачная полиэтиленовая лента с липким слоем для детского творчества, но лучше использовать операционную пленку ЛПО-1, ЛПО-2) длиной 8-10 см приклеивают липким слоем к перианальным складкам кожи, держа за концы, а затем переносят ее на предметное стекло липким слоем вниз (концы ленты, выходящие за края стекла отрезают), стекла нумеруются, а в журнале записываются данные больного и номер стекла. В лаборатории ленту с одного конца отклеивают на большом протяжении, капают под нее 1-2 капли вазелинового масла или глицерина (для устранения оптических дефектов) и микроскопируют;

д) соскоб с помощью стеклянных глазных палочек, поверхность которых покрыта специльным клеевым составом. Глазные палочки устанавливаются в специальный штатив. Забор материала производится путем соприкосновения плоской части лопаточки к коже перианального отверстия. Затем палочка снова укрепляется в штатив для транспортировки. Микроскопия проводится непосредственно на лопаточке с обеих сторон (без предметных и покровных стекол) с предварительным креплением в кассеты при малом увеличении (окуляр х 10, объектив х 8). По окончании работы палочки дезинфицируются кипячением в мыльном растворе, а штатив и кассеты обрабатываются спиртом и промываются мыльно-содовым раствором. Состав клея: клеол – 10 г, касторовое масло – 2,5 г, этиловый эфир – 5 г, этиловый спирт 96% - 2,5 г.

Лопаточки обмакиваются в раствор клея, затем высушиваются на воздухе при комнатной температуре. Образовавшаяся на поверхности клейкая пленка сохраняется в течение нескольких дней.

Метод удобен при массовом обследовании детского населения на энтеробиоз и взрослого населения на тениидозы.

Дополнительно к методу соскоба при тениаринхозе и тениозе применяются также метод опроса и описанный выше макроскопический метод (при выявлении члеников).

Специальные методы исследования на стронгилоидоз

Применяют эфир-уксусный метод для обнаружения яиц (см. выше) и метод Бермана для обнаружения личинок в испражнениях.

Метод Бермана . Исследуют свежий кал, лучше после принятия слабительного. Пробу фекалий 5 г помещают на металлическое сито (сетку внутри выстилают двумя слоями марли) в стеклянную воронку, закрепленную в штативе. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом (аппарат Бермана).

Сетку с испражнениями приподнимают и в воронку наливают нагретую до 40-50°С воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки была погружена в воду и кал покрылся водой целиком. Через 2-4 ч зажим на резиновой трубке быстро открывают, и жидкость спускается в центрифужную пробирку. После центрифугирования (1-2 мин) верхнюю часть жидкости быстро сливают, а осадок в количестве 1 мл наносят тонким слоем на предметное стекло и микроскопируют под малым увеличением микроскопа.

Метод ИМП и ТМ . В химический стаканчик помещают порцию фекалий величиной с орех, заливают теплым 40°С физраствором, чтобы фекалии покрылись раствором, оставляют на 20 мин. Через 20 мин сливают жидкость в чашку Петри и просматривают под бинокулярным микроскопом МБС.

Для диагностики стронгилоидоза, особенно для контроля за эффективностью лечения, рекомендуется сочетать метод Бермана с исследованием дуоденального содержимого.

Специальные методы исследования на нематодозы

Нематозы

Аскаридоз

В анамнезе обращается внимание на отношение к огородничеству, садоводству. Употребление в пищу сырых овощей, салатов, приготовленных из этих овощей.

Клинические проявления ранней фазы аскаридоза обусловлены аллергическими перестройками организма. Ранняя или миграционная личиночная стадия аскаридоза протекает нередко при наличии лихорадки с температурой тела до 38° и выше, с симптомокомплексом поражения легких, наличием выраженной эозинофилии крови. В большинстве случаев у детей первыми признаками заболевания являются недомогание, слабость, периодические головные боли, потливость, иногда боли в мышцах, суставах. Нередко появляется обильная сыпь типа крапивницы с сильным или умеренным зудом. Диагноз ранней фазы подтверждается рентгенологическими исследованиями на наличие в легких летучих эозинофильных инфильтратов Леффлера. В мазках свежевыделенной мокроты нередко обнаруживаются эозинофильные клетки, эритроциты, кристаллы Шарко-Лейдена и личинки аскарид.

При кишечной имагинальной стадии аскаридоза отмечается сочетание проявлений со стороны желудочно-кишечного и астенического синдромов, энтероколитический болевой симптомы. У детей нередко отмечается снижение в весе, порой довольно значительно. Тошнота, повышенная саливация, раздражительность, задержка психомоторного развития, снижение интеллекта.

Для лабораторной диагностики кишечной ст

Ершова И.Б. , Осычнюк Л.М. , Мочалова А.А. , ГУ «Луганский государственный медицинский университет», кафедра педиатрии с детскими инфекциями.
Статья опубликована в журнале «Актуальная инфектология», №2 (3), 2014 год.
Информационный ресурс «Издательский дом Заславский» www.mif-ua.com

В статье изложены методы диагностики гельминтных инвазий: микроскопические, иммуноферментный анализ, серологические, полимеразной цепной реакции, биорезонансная диагностика, гемосканирование, а также инструментальные (ультразвуковое и рентгенологическое исследование, компьютерная томография) и лабораторные, имеющие косвенное значение (клинический анализ крови, анализ крови на печеночные пробы, анализ кала на дисбактериоз). Описаны достоинства методов, их недостатки, достоверность полученных данных. Предложены анкеты-опросники для пациентов для выявления риска инфицирования гельминтами. Описаны достоинства методов, их недостатки, достоверность полученных данных. Предложены анкеты-опросники для пациентов для выявления риска инфицирования гельминтами.

Гельминты оказывают отрицательное воздействие на организм человека. Они приводят к аллергизации, развитию полигиповитаминоза, макро- и микроэлементозов, нарушению кроветворения и проницаемости сосудов, гормональному дисбалансу. Гельминтозы способствуют формированию хронических заболеваний (холецистит, желчнокаменная болезнь, панкреатит, колит, сахарный диабет, бронхиальная астма, атопический дерматит), психоэмоциональных нарушений (хроническая усталость, раздражительность, тревожность, гиперактивность у детей), анемии и др. При длительной гельминтной инвазии может развиваться вторичный иммунодефицит .

Настороженность врачей в отношении гельминтозов у населения в настоящее время недостаточная, а профилактика сводится к лечению выявленных инвазированных пациентов.

Диагностика гельминтозов основывается на клинико-эпидемических и лабораторных данных. Такие признаки, как астенический синдром, рецидивирующая крапивница, нарушение регенерации кожи и слизистых оболочек, трудно поддающиеся лечению атопический дерматит и бронхообструктивный синдром, полилимфаденопатия и гепатоспленомегалия неясного генеза, аденоидные вегетации II–III степени, «географический» язык, сниженный или избирательный аппетит, неустойчивый стул, могут говорить о наличии гельминтов .

При серологическом исследовании определяют наличие антител к гельминтам (достоверность - около 60 %): при подозрении на эхинококкоз, цистицеркоз, трихинеллез, токсокароз широко используют реакции непрямой гемагглютинации, агглютинации латекса, связывания комплемента, иммунофлюоресценции .
Не во всех случаях методы определения специфических антител обладают достаточной специфичностью и достоверностью. Антигенный состав гельминта зависит не только от вида, но и от стадии; проходя сложный цикл развития от яйца до взрослой особи, гельминты меняют антигенный состав. Кроме того, в иммунодиагностических реакциях используются соматические антитела, а в организме хозяина антитела вырабатываются в основном на экскреты и секреты гельминта. Неспецифическая сенсибилизация организма, общность некоторых антигенов трематод, простейших и человека создают высокий удельный вес ложноположительных реакций в титрах ниже достоверно диагностических .

Метод определения гельминтов с помощью полимеразной цепной реакции является высокоспецифичным и высокочувствительным, но из-за дороговизны и сложности не может быть скрининговым, когда, например, нужно обследовать группу детей из детского учреждения .

Иммунная система не всегда реагирует (распознает и уничтожает) на наличие гельминтов в организме. Это объясняется тем, что некоторые гельминты имеют прочную и химически устойчивую капсулу или покрыты веществом, которое не распознается иммунной системой; локализуются в тканях, наиболее защищенных от воспалительных реакций, например в спинном мозге; многие виды из них в пищеварительном тракте выделяют антиэнзимы, что спасает их от гибели; имеют большую продолжительность жизни (годами, а иногда до смерти самого человека); питаются за счет гликолиза чистых углеводов; имеют такие приспособления, как присоски, крючки и др., что способствует фиксации внутри организма; у многих видов существует половое размножение, при котором происходит обмен генной информацией, что приводит к усилению гетерогенной популяции, уменьшению уязвимости; обладают высоким уровнем плодовитости.

При ультразвуковом , рентгенологическом исследовании органов брюшной полости , компьютерной томографии можно выявить косвенные признаки гельминтозов: гепатоспленомегалию, неравномерность паренхимы печени и селезенки за счет мелких гиперэхогенных сигналов, увеличенные лимфатические узлы в воротах селезенки и сами гельминты (эхинококки, клубки кишечных гельминтов и т.д.).

Гемосканирование - качественное исследование крови с помощью мощного темнопольного микроскопа, можно увидеть состояние клеток крови (форму, размер, активность, цвет и т.д.), наличие неспецифических элементов и веществ - все это напрямую или опосредованно говорит о наличии в организме гельминтов. Изображение выводится на экран монитора с помощью встроенной видеокамеры в микроскопе. Этот метод диагностики обладает высокой достоверностью .

Косвенными лабораторными признаками гельминтозов могут быть анемия, базофилия, эозинофилия, увеличение уровня аспартатаминотрансферазы. Так, при токсокарозе выявляется лейкемоидная реакция эозинофилов (более 20 %) на фоне стойкого аллергического синдрома (атопический дерматит с выраженным зудом и резистентностью к традиционной терапии, тяжелая бронхиальная астма). Угнетение нормальной кишечной палочки в анализе кала на дисбактериоз также может говорить о возможном гельминтозе.

С учетом распространенности гельминтозов мы предлагаем анкету для определения риска инфицирования гельминтами.

• Купаетесь в пресноводных водоемах.
• Не моете руки перед едой с мылом в горячей воде.
• Употребляете воду из непроверенных источников.
• Употребляете в пищу домашнее сало с прожилками мяса.
• Употребляете в пищу малосольную рыбу.
• Употребляете в пищу слабопрожаренное мясо (с кровью).
• Употребляете в пищу малосольную икру незаводского приготовления.
• Не моете куриные яйца с мылом.
• Не моете бананы, апельсины, мандарины перед употреблением.
• Удобряете огород навозом.
• Употребляете овощи прямо с грядки.
• Употребляете фрукты и ягоды прямо с грядки.
• Употребляете упавшие фрукты.
• Не обдаете всю зелень кипятком для приготовления салатов.
• Храните морковь в песке, взятом в дворе.
• Ходите босыми ногами по траве.
• У членов семьи были глистные инвазии.
• В семье имеется собака или кошка.

За каждый ответ «да » - 2 балла, «иногда » - 1, «нет » - 0. При сумме баллов 0–5 вероятность инфицирования ничтожно мала, 6–12 - возможно инфицирование, 13–25 - высокая вероятность, более 25 баллов - очень высокая. При двух последних результатах необходимы регулярное обследование и, возможно, профилактическое лечение.

Поскольку клинические проявления гельминтозов не всегда специфичны, а в начальних стадиях - неспецифичны, мы предлагаем анкету для пациентов для самодиагностики гельминтозов .

• Бывает зуд в области ануса по утрам.
• Тошнота по утрам при чистке зубов.
• Шелушение пальцев рук или ног со слущиванием пластов кожи.
• Аллергическая сыпь на коже, кожный зуд.
• Шелушение и отечность в области век.
• Повышенная утомляемость, вялость, сонливость.
• Повышенное чувство голода.
• Чувство дискомфорта в животе.
• Снижение массы тела.
• Наличие нескольких хронических заболеваний органов желудочно-кишечного тракта, суставов, бронхолегочной системы.
• Плохое самочувствие, отсутствие официального диагноза, длительное неэффективное лечение.
• Периодический подъем температуры, сопровождающийся мышечными и суставными болями.

Ответ «да » по крайней мере на 2–3 вопроса говорит о высокой вероятности заражения гельминтами.

ВЫВОДЫ

1. На современном этапе нет лабораторных методов исследования на гельминтозы, которые обладают 100% надежностью.

2. Наибольшей достоверностью в диагностике гельминтозов обладают полимеразная цепная реакция и биорезонансная диагностика.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Исследование фекалий

Микроскопирование вначале проводят при слабом увеличении (Х80). Простейших можно заменить по более сильной преломляемости света, а некоторые виды - по их движению или изменению формы. Объект, замеченный при малом увеличении, рассматривают при увеличении 400 или 600. При отсутствии опыта просмотр мазков следует производить сразу при большом увеличении, что, однако, значительно увеличивает время на изучение препарата. Просмотр мазков при большом увеличении следует производить при более сильном освещении, регулируя его с помощью конденсора.

Дифференциальными признаками отдельных видов амеб в нативном мазке являются форма и размер тела, видимость ядра, характер образования псевдоподий, движение, деление цитоплазмы на экто- и эндоплазму, характер включений (фагоцитированные эритроциты и др.). При дифференцировке видов жгутиконосцев - размер и форма тела, количество жгутиков, характер передвижения, наличие или отсутствие ундулирующей мембраны. Специфическими признаками балантидиев являются размер, форма тела, движение, реснички, цитостом и др.

Основным отличительным признаком вегетативных форм простейших в живом состоянии служит движение. В мазках встречаются различного рода неподвижные образования - растительная клетчатка, мышечные волокна, споры, грибки и т.д. Они не должны приниматься во внимание при протозоологической диагностике.

Метод нативного мазка прост и доступен для любой лаборатории. Он позволяет при нахождении тканевых форм дизентерийных амеб с фагоцитированными эритроцитами поставить совершенно точный диагноз амебной дизентерии, а при обнаружении балантидиев и лямблий - диагноз балантидиаза и лямблиоза.

Окраска мазков раствором Люголя . Эта окраска применяется для диагностики простейших по цистам. Ею пользуются при исследовании оформленного, полуоформленного и кашицеобразного кала.

Для приготовления мазка конец деревянной палочки пачкается в фекалиях и обмывается в капле йодного раствора (J - 1,0 г, KJ - 2 г, дистиллированная вода - 100 мл), нанесенного на предметное стекло, до получения равномерной эмульсии. Препарат накрывают покровным стеклом и через 3 – 5 мин. микроскопируют. Мазок должен быть достаточно прозрачным для изучения его в проходящем свете.

Среди остатков непереваренной пищи, спор, грибков, йодофильных бактерий цисты простейших, окрашенные в коричневый или зеленовато-желтый цвет, выделяются строго определенной, характерной для каждого вида формой, размером, отчетливыми очертаниями краев, наличием гладкой, прозрачной, двухконтурной оболочки, содержимым цитоплазмы, а также наличием ядер с нечетко выраженной структурой. В цистах амеб заметны окрашенные в коричневый (темно-бурый) цвет гликогеновые вакуоли. Степень окраски этих вакуолей и очертания их границ варьируют в цистах простейших одного и того же вида в зависимости от их зрелости.

7.7. Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов

Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы.

7.7.1. Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду

Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели она распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли, так называемые "нитки жемчуга".

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от их места нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина - 0,5 г, натрия бикарбоната - 0,09 г, дистиллированной воды - 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36 - 38 °С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6 - 8 часов в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1%-ный раствор натрия сульфида или 20%-ный раствор натрия гипохлорида, или же в 1%-ный раствор хлорной воды при 36 - 38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем "растворяются" в течение 10 минут - 2 часов. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1%-ного раствора натрия хлорида, 0,5%-ного раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36 - 38 °С.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня наиболее проста методика Иониной Н.С.: у живых яиц медианная пара эмбриональных крючьев или параллельна латеральным, или последние образуют с медианной угол у основания меньше 45°. У мертвых яиц латеральные пары образуют у основания угол с медианной парой больше 45° или же крючья беспорядочно разбросаны (утрачивается их парное расположение); иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5 - 10° до 38 - 40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых яиц нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3%-ный раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24 - 30 °С, яйца власоглавов в 3%-ном растворе соляной кислоты при температуре 30 - 35 °С; яйца остриц в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 37 °С. Чашки Петри следует открывать 1 - 2 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2 - 3 месяцев свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых дней развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, наливают осторожно на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1 - 2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25 - 30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5 - 7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом.

Яйца трематод, естественно развивающиеся в воде, например описторхисов, дифиллоботриид, фасциол и других, помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они развиваются быстрее в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22 - 24 °С через 9 - 12 суток формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету.

Метод Фюллеборна. Личинки анкилостомид и стронгилид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После выдерживания в термостате при температуре 25 - 30 °С в течение 5 - 6 часов личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий.

Метод Харада и Мори. В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15 х 150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Накрывают верхний конец куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер, фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят 8 - 10 суток при температуре 28 °С. Для изучения личинок снимают и удаляют целлофановую крышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 минут, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными таблицы 3.

Таблица 3

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ФИЛЯРИЕВИДНЫХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.

Личинки	Размеры	Характерные признаки
A. duodenale	Длина тела около 660 мкм, чехлика - 720 нм	Исчерченность чехлика менее выражена, ротовой выступ менее заметен, передний конец тела (но не чехлика) тупой, диаметр кишечной трубки меньше, чем бульбус пищевода, хвостовой конец тупой
N. americanus	Длина тела около 590 мкм, чехлика - 660 нм	Чехлик заметно исчерчен, особенно в хвостовой части тела, ротовой выступ кажется темным, передний конец тела (но не чехлика) закруглен подобно узкому концу куриного яйца, передняя часть кишечной трубки такого диаметра, как бульбус пищевода, хвостовой конец резко заострен
S. stercoralis	Длина тела около 500 мкм	Личинка без чехлика, пищевод составляет около половины длины тела, хвост тупой или разветвленный
Trichostrongylus sp.	Длина тела около 750 мкм	Просвет кишечника не прямой, а зигзагообразный, хвостовой конец закруглен и имеет форму кнопки

7.7.2. Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов

Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Для дифференциального определения живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей часто используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцирует метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Критерием состояния яйца является окрашивание зародыша, но не оболочки. Такая его способность связана с условиями гибели яйца. В тех случаях, когда волокнистая оболочка в мертвом яйце не теряет свойств полупроницаемости, она не будет пропускать красители, следовательно, мертвый зародыш не будет окрашиваться. Окрашенный зародыш всегда свидетельствует о гибели яйца.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты - 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают; окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц. Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному стеклу при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости; после чего этот же препарат просматривают повторно через 2 - 3 часа. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 часов. Мертвые личинки или не выходят из яиц, или окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).

При определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц возможна окраска препаратов 5%-ным спиртовым раствором йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1 - 3 сек. окрашиваются в оранжевый цвет.

Мертвые яйца описторхисов и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают их сафранином (в разведении 1:10000 спирта 10 °С). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин окрашивает в красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет; яйца с мертвыми зародышами - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином или в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000, или индигокармином в разведении 1:1000 - 1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2 - 7 часов.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски:

1. Бриллианткреазиловый синий (1:8000) - через 1 час у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остальной части яйца.

2. Сафранин (1:8000 при воздействии в течение 2 часов и 1:5000 - в течение 3 - 5 часов).

3. 50%-ный раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 часа при температуре 29 - 30 °С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

7.7.3. Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов

Люминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции используются не ультрафиолетовые лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю ОИ-18 добавляют специальный набор цветных фильтров.

Живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин, ауролин, сульфат берлерина, трипафлавин, риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные, живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая часть; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых - и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет, у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы.

При вторичной люминесценции (при окраске акридин оранжевым в разведении 1:10000 и 1:50000 от 30 минут до 2 часов) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых яиц аскарид, токсокар, остриц, карликовых цепней, крысиных цепней, бычьего цепня, лентецов окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых яиц аскарид, токсаскарисов, крысиного цепня, широкого лентеца и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши яиц этих гельминтов излучают "горящий" оранжево-красный цвет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в "горящий" светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, в ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет.

Живые яйца трематод (парагонимусов и клонорхисов) не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый цвет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10 - 15 минут после гибели проявляются ярким "горящим" светло-зеленым, а затем - оранжево-красным светом.

7.7.4. Метод биологической пробы

Например, для определения жизнеспособности яиц аскаридат (аскариды свиные, человека, токсокары, токсаскарис и др.) на одно животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100 - 300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинки. Через 6 - 7 суток животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют их по методу Бермана или Супряги (раздел 6.1.2).

Если животных заражали живыми инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат.

В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 месяца, у морских свинок - через 50 суток, у мышей - через 35 - 40 суток.

Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20 - 30 суток и исследуют печень на наличие молодых фасциол.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание незараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92 - 96 часов и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника.

Для определения жизнеспособности яиц описторхисов рекомендуется метод (Герман С.М., Бэер С.А., 1984), основанный на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки, что приводит к открыванию крышечки яйца и активному выходу мирацидия в экспериментальных условиях.

Взвесь яиц описторхисов в воде предварительно охлаждают до 10 - 12 °С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19 - 20 °С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100 - 150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5 - 10 минут. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумагой осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-HCl буфере; в буфер добавляют 12 - 13%-ный раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 минут, слегка покачивая. Затем добавляют 2 капли указанной среды. Препарат готов для микроскопирования под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении.

За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2 - 5 минут обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить и посчитать при микроскопировании.