Обладнання та реактив: хроматографічний папір; хроматографічна камера; фотоелектроколориметр; ножиці; пластинки скляні (3'32 см) – 3 шт.; тримач для хроматограм; сушильна шафа; мікропіпетки; пробірки із притертими пробками; бюретка на 25мл; стандартна суміш амінокислот; випробувана суміш амінокислот; бутанол, оцтова кислота, вода у співвідношенні 15:3:7; 1% розчин нінгідрину в 95% ацетоні; етиловий спирт (75%-ний), насичений мідним купоросом.

Виконання роботи

Беруть лист хроматографічного паперу розміром 1828 см і на відстані 3 см від його короткого краю проводять простим олівцем горизонтальну лінію. Потім її ділять на нерівні відрізки відповідно до схеми, що додається, і виділяють стрілками межі нанесення стандартної і випробуваної сумішей і роблять відповідні написи простим олівцем.

Папір зміцнюють над поверхнею столу і на лінію старту, обмежену стрілками, спочатку наносять стандартну суміш за допомогою спеціальної мікропіпетки тонкою лінією, поки весь розчин з мікропіпетки не буде перенесений на стартову лінію (мікропіпетку заповнюють на 2-3 см). Вимірюють масу нанесеного розчину, для чого зважують піпетку, заповнену стандартною сумішшю (до нанесення розчину) і порожню (після нанесення розчину). На папір зазвичай наносять 0,02-0,03 г стандартного розчину. Потім заповнюють чисту піпетку випробуваною сумішшю амінокислот (виданої викладачем для дослідження), зважують її і суміш наносять на лінію старту з відповідною позначкою.

Приготовлену хроматограму поміщають у хроматографічну камеру з попередньо налитою в неї системою розчинників для поділу суміші амінокислот, наприклад, суміші бутанолу, оцтової кислоти та води у співвідношенні 15:3:7. Поділ ведуть методом висхідної хроматографії, доки лінія фронту не дійде на 2-3 см до верхнього краю хроматографічного паперу (лінія фінішу). Після цього хроматограму виймають з камери і верхній кінець паперу негайно вставляють у тримач, зроблений з трьох скріплених гумовим кільцем скляних паличок, і поміщають на 20 хв у витяжну шафу для видалення з паперу розчинників.

Рис. 8. Схема розташування амінокислот на хроматограмі:

А – точка нанесення суміші амінокислот; I - цистин та цистеїн;

2 – лізин; 3 – гістидин; 4 – аргінін; 5 - аспарагінова кислота,

серії та гліцин; 6 - глутамінова кислота та треонін; 7 - аланін;

8 - пролін; 9 – тирозин; 10 - валін та метіонін; II – триптофан;

12 - фенілаланін; 13 – лейцин та ізолейцин

Висушену хроматограму вмочують в 1% розчині нінгідрину в ацетоні для виявлення на ній положення плям амінокислот. Потім хроматограму поміщають на 10 хв у витяжну шафу для видалення ацетону і переносять у сушильний шафу, де залишають її на 15 хв при 70°С. Амінокислоти стандартної та випробуваної сумішей виявляють у вигляді синьо-фіолетових плям, розташованих ланцюжком у напрямку руху системи розчинників від лінії старту до верхнього краю хроматограми.

Ідентифікацію амінокислот, що містяться в випробуваній суміші, ведуть збігу на хроматограмі позицій, займаних амінокислотами стандартної та випробуваної сумішей (рис. 8).

Для визначення кількісного вмісту амінокислот у випробуваних сумішах хроматограму розкреслюють простим олівцем так, щоб забарвлені зони, що лежать на одному рівні, відповідні одній і тій же амінокислоті, виявилися ув'язненими всередині приблизно однакових прямокутників (рис. 9).

I II III IV

Рис. 9. Схема розташування амінокислот на хроматограмі:

I – суміш № I; II - суміш №2; 1У - суміш №3; Ш – стандартна

суміш амінокислот

Окреслені ділянки папір вирізують та поміщають у пробірки, номери яких повинні відповідати номерам плям на хроматограмах. У кожну пробірку наливають з бюретки по 10 мл 75% розчину етилового спирту, насиченого сульфатом меду (до 500 мл етилового спирту додають 0,2 мл насиченого розчину сульфату міді). Пробірку закривають пробкою і, періодично перемішуючи, домагаються повного переходу цегляно-червоного забарвлення (мідної солі синьо-фіолетового Руемана) з паперу розчин. На це йде 15-20 хв. Абсорбцію (оптична щільність) стандартного та випробуваного розчинів вимірюють на фотоелектрокалориметрі із зеленим світлофільтром (540 нм). У потік порівняння встановлюють кювету з 75% розчином етилового спирту з сульфатом міді.

Кількісний вміст амінокислот у досліджуваному розчині розраховують за співвідношенням екстинкцій досліджуваної та стандартної проб.

Приклад розрахунку. Припустимо, що стандартної суміші міститься 1,8 мг гліцину в I мл, на стартову смугу нанесено 0,02 г цього стандартного розчину. Отже, на хроматограму надійшло (1,8 0,02) = 0,036 мг гліцину. Умовимося далі, що абсорбція пофарбованих розчинів склала 0,288 для стандарту та 0,336 для невідомої суміші. Тоді вміст гліцину досліджуваної суміші, нанесеної на хроматограму, складе (36'0,336): 0,288=42 мкг. Якщо далі прийняти, що досліджувана суміш нанесена на хроматограму в кількості, наприклад 0,0250 г, вміст гліцину в 1 мл досліджуваного розчину складе (42:0,0250) = 1680 мкг, або 1,68 мг/мл.

Оформіть результати власного експерименту, зробіть висновки.

Лабораторна робота №15

Поділ іонівFe 3+ , Co 2+ , Ni 2+

Амінокислоти можна виявити за допомогою кольорових реакцій: нінгідринової, ксантопротеїнової, Фоля, Мілона, біуретової проби та ін Ці реакції неспецифічні, т.к. засновані на виявленні окремих фрагментів у структурі амінокислот, які можуть траплятися і в інших сполуках.

Нінгідринова реакція, кольорова реакція, що застосовується для якісного та кількісного визначення амінокислот, амінокислот та амінів При нагріванні в лужному середовищі нінгідрину (трикетогідринденгідрату, С 9 Н б Про 4) з речовинами, що мають первинні аміногрупи (-NH 2), утворюється продукт, який має стійке інтенсивне синьо-фіолетове забарвлення з максимальним поглинанням близько 570 нм. Оскільки поглинання при цій довжині хвилі лінійно залежить від числа вільних аміногруп, нінгідринова реакція послужила основою для їх кількісного визначення методами колориметрії або спектрофотометрії. Ця реакція використовується також для визначення вторинних аміногруп (NH) в імінокислотах - проліні та оксипроліні; у цьому випадку утворюється продукт яскраво-жовтого кольору. Чутливість – до 0,01%. Сучасний автоматичний амінокислотний аналіз проводять, поєднуючи іонообмінний поділ амінокислот та кількісне визначення їх за допомогою нінгідринової реакції. При поділі сумішей амінокислот методом паперової хроматографії дозволяє визначати кожну амінокислоту в кількості не менше 2-5 мкг.

За інтенсивністю фарбування можна будувати висновки про кількості амінокислот.

Ця реакція позитивна як із вільними амінокислотами, а й пептидами, білками та інших.

Ксантопротеїнова реакціядозволяє виявити ароматичні амінокислоти (фенілаланін, тирозин, гістидин, триптофан), заснована на реакції електрофільного заміщення в ароматичному ядрі (нітрування).

При дії концентрованої азотної кислоти, наприклад, тирозин утворюється продукт, пофарбований у жовтий колір.

Реакція фолю.Це реакція на цистеїн та цистин. При лужному гідролізі «слабозв'язана сірка» в цистеїні та цистині досить легко відщеплюється, у результаті утворюється сірководень, який, реагуючи з лугом, дає сульфіди натрію або калію. При додаванні ацетату свинцю (II) утворюється осад сульфіду свинцю (II) сіро-чорного кольору.

Опис досвіду. У пробірку наливають 1 мл розчину цистину, додають 0,5 мл 20% розчину гідроксиду натрію. Суміш нагрівають до кипіння, потім додають 0,5 мл розчину ацетату свинцю(II). Спостерігається випадання сіро-чорного осаду сульфіду свинцю (II):

Реакція Ціммермана.Це реакція на амінокислоту гліцину.

Опис досвіду. До 2 мл 0,1%-го розчину гліцину, доведеного додаванням 10%-го розчину лугу до рН = 8, доливають 0,5 мл водного розчину о-фталевого діальдегіду. Реакційна суміш починає повільно фарбуватись у яскраво-зелений колір. За кілька хвилин випадає зелений осад.

Реакція на триптофана.Триптофан, реагуючи у кислому середовищі з альдегідами, утворює забарвлені продукти конденсації. Наприклад, з гліоксиловою кислотою (що є домішкою до концентрованої оцтової кислоти) реакція протікає за рівнянням:

За аналогічною схемою протікає і реакція триптофану з формальдегідом.

Реакція Сакагучі.Ця реакція на амінокислоту аргінін заснована на взаємодії аргініну з -нафтолом в присутності окислювача. Її механізм ще повністю не з'ясований. Очевидно, реакція здійснюється за наступним рівнянням:

Оскільки похідні хінонімінів (у даному випадку нафтохінону), у яких водень іміногрупи –NH– заміщений на алкільний або арильний радикал, завжди пофарбовані в жовто-червоні тони, то, мабуть, оранжево-червоний колір розчину при проведенні реакції Сакагучі пояснюється виникненням саме похідного нафтохіноніміну. Не виключена, однак, ймовірність утворення ще більш складного з'єднання за рахунок подальшого окислення NH-груп аргінінового залишку і бензольного ядра α-нафтола, що залишилися:

Опис досвіду. У пробірку наливають 2 мл 0,01% розчину аргініну, потім додають 2 мл 10% розчину їдкого натру і кілька крапель 0,2% спиртового розчину -нафтола. Вміст пробірки добре перемішують, доливають 0,5 мл розчину гіпоброміту та знову перемішують. Негайно додають 1 мл 40%-го розчину сечовини для стабілізації оранжево-червоного фарбування, що швидко розвивається.

Біуретова реакція- Використовується як кольорова реакція на білки. У лужному середовищі у присутності солей міді(II) вони дають фіолетове забарвлення. Забарвлення обумовлене утворенням комплексної сполуки міді(II), за рахунок пептидної групи -СО-NH-яка характерна для білків. Свою назву ця реакція одержала від похідного сечовини - біурету, який утворюється при нагріванні сечовини з відщепленням аміаку:

Крім білків і біурету таке ж фарбування дають і інші сполуки, що містять цю групу: аміди, іміди карбонових кислот, а також сполуки, що містять в молекулі групи -CS-NH- або =CH-NH-. Також реакцію дають білки, деякі амінокислоти, пептиди, біурет та середні пептони.

Колір комплексу, що отримується при біуретової реакції з різними пептидами, дещо відрізняється і залежить від довжини пептидного ланцюга. Пептиди з довжиною ланцюга від чотирьох амінокислотних залишків та вище утворюють червоний комплекс, трипептиди – фіолетовий, а дипептиди – синій.

кетонна форма поліпептиду

єнольна форма поліпептиду

При взаємодії поліпептиду з Cu(OH)2 утворюється комплекс, будову якого можна показати так.

Методи визначення амінокислот

Амінокислоти є біологічно активними речовинами, вони відіграють велику роль у життєдіяльності організму людини, їх широко використовують як лікарські засоби. Частина є незамінними і вступають у організм разом із їжею. В даний час існує ряд методів кількісного визначення амінокислот у лікарській рослинній сировині, у лікарських препаратах та біологічних рідинах, у харчових продуктах.

З усього різноманіття методів кількісного визначення амінокислот у різних об'єктах, можна виділити чотири основні групи: хроматографічні, спектрофотометричні, титриметричні та електрохімічні методи аналізу.

Хроматографічні методи

За останні десятиліття досягнуто значних успіхів у галузі газорідинної хроматографії амінокислот. Запропоновано метод з використанням мікронабивних колонок, що дозволяє за порівняно короткий час розділяти практично повністю 17 важливих біологічно-амінокислот.

Розроблено методику визначення амінокислот за допомогою газорідинної хроматографії у зразках сироватки, плазми, сечі та спинномозкової рідини, засновану на отриманні 2,3,4,5,6-пентафторбензоїл-ізобутилових ефірів з подальшим поділом на колонці з полідиметилсилоксану в режимі До 250°С з полум'яно-іонізаційним детектором. Час хроматографічного поділу становить 28 хв. В результаті досліджень вдалося розділити 27 амінокислот.

Незважаючи на різноманітність методик високоефективної рідинної хроматографії в аналізі амінокислот, найбільш експресним і доступним є звернено-фазовий варіант зі спектрофотометричним детектуванням. Для успішного поділу та детектування амінокислоти переводять у гідрофобні та поглинаючі світло похідні, тобто проводять передколоночну дериватизацію. Як реагенти для дериватизації застосовують ортофталевий альдегід, нафталін-2,3-дикарбоксиальдегід, 9-флуоренілметилхлороформіат.

Розроблено методику кількісного визначення L-цистину, L-глутамінової кислоти та гліцину в лікарському препараті «Елтацин», що має антиоксидантну активність у поєднанні з антиангінальним ефектом. Глутамінову кислоту та гліцин визначали методом звернено-фазової високоефективної рідинної хроматографії після передколонної дериватизації з реагентом ортофталевий альдегід/N-ацетил-L-цистеїн. Дериватизація цистеїну, за даними авторів, утруднена через нестабільність самої амінокислоти і похідних, що утворюються. Тому аналіз цистеїну проводили методом броматометричного титрування. Встановлено, що присутність у зразку значних кількостей цистеїну не заважає визначенню продуктів дериватизації гліцину та глутамінової кислоти з реагентом ортофталевий альдегід/N-ацетил-L-цистеїн. Метод характеризується високою відтворюваністю та точністю визначення.

Досліджено можливість використання 4,7-фенантролін-5,6-діону (фанхінону) як флуорогенного реагенту-мітки для передколонкового утворення його похідних з метою поділу та кількісного аналізу амінокислот методом високоефективної рідинної хроматографії. Фанхінон, що не володіє власною флуоресценцією, реагує з аміногрупами амінокислот (при 68 °С протягом 160 хв), утворюючи імінохіноли, флуоресценцію яких вимірюють при довжині хвилі 460 нм. Виділені похідні ідентифікували по Тпл, ІЧ-, мас-, та ПМР-спектрам. Високоефективну рідинну хроматографію проводили на хроматографі з флуоресцентним детектором і колонкою при градієнтному елююванні сумішами: розчин триетиламіну - фосфатний буфер (рН 3) - метанол. Як внутрішній стандарт використовували хінідин. Даний метод досить перспективний за умов великих лабораторій і може бути запропонований для аналізу амінокислот у готових лікарських формах.

Розроблено методику високоефективної рідинної хроматографії з потенціометричним біосенсором для кількісного визначення лізину. Біосенсор сконструйований прикріпленням, що містить лізиноксидаз, мембрани до іонно-селективного NH4+ - електроду. Генеровані при ферментативної деградації лізину іони амонію детектують потенціометрично. Розроблено хроматоденситометричний експрес-метод аналізу в культуральних рідинах триптофану. Тонкошарову хроматографію проводили на платівках «Сорбфіл». Хроматографію здійснювали у системі пропанол-2 - 25 % розчин амонію гідроксид (7:3) протягом 25 хвилин. Хроматограми висушували за кімнатної температури і 15 хв витримували при 120°С. Для виявлення плям на хроматограмах використовували специфічний реагент - 4-диметиламінобензальдегід, вибірковий до індольного кільця триптофану, у вигляді 0,5% етанолового розчину з додаванням 5% сірчаної кислоти концентрованої. Після прояву хроматограм способом занурення в тефлонову кювету зі свіжоприготованим розчином 4-диметиламінобензальдегіду, їх витримували протягом 5-7 хвилин при температурі 110°С. Сканування плям триптофану проводили за довжини хвилі 625 нм на комп'ютерному відеоденситометрі. Розроблений метод, незважаючи на високу точність визначення та продуктивність, специфічний по відношенню до триптофана.

Для аналізу?-амінокислот у біологічних рідинах, лікарських препаратах, продуктах харчування широко використовуються методи капілярного електрофорезу, засновані на поділі компонентів складної суміші в кварцовому капілярі під дією прикладеного електричного поля. Оскільки амінокислоти мають цвіттеріонний характер, вони можуть бути розділені з використанням буферних розчинів електролітів з відповідним значенням рН, найчастіше використовують нейтральні та основні буферні розчини, що розділяють .

З метою підвищення специфічності та чутливості методу капілярного електрофорезу для аналізу окремих?-амінокислот використовують їх попередню дериватизацію, з подальшим поділом у кварцовому капілярі та спектрофотометрічним визначенням продуктів реакції. Так, як дериватизирующих агентів використовують 9-флуоренілметилформіат, 9-(2-карбазол)-етилхлорформіат, ціаніновий барвник. Перспективність методу обумовлена ​​такими його перевагами, як експресність аналізу, простота підготовки проби, невелика витрата реактивів, простота апаратурного оформлення.

І білків

Відомо, що всі 20 різновидів канонічних α-амінокислот мають однотипну структуру з трьома варіантами функціональних груп (рис. 3.3). На жаль, реакцію аміно- і карбоксигруппы малоспецифічні, т.к. відповідно, властиві всім амінам, ряду амідів та карбонових кислот. Те саме відноситься і до більшості їх радикалів = R, 10 з яких неполярні, тобто представлені аліфатичними вуглеводневими групами, більшість яких хімічно інертно. Відносно низька та специфічність більшості R полярних амінокислот, у яких зустрічаються спиртові (Сер, Тре, Тир) амідні (Асн, Глн) та карбоксигрупи (Асп, Глу). Більш активними є аміногрупа (Ліз), імідазол Гіс та гуанідиногрупа Арг, а максимальна активність тіогрупи Цис. Тому найбільшого практичного значення в якісному та кількісному аналізі α-амінокислот, у тому числі і в амінокислотних аналізаторах, набула універсальна нінгідринова реакція, специфічна для одночасної присутності у α-С атома, як аміно-, так і карбоксигрупи.

Рис. 3.3. Загальні формули структури -амінокислот і продукту їх полімеризації. Пояснення у тексті.

Полімеризація α-амінокислот у структуру пептидів та білків (рис. 3.3) зберігає всі типи їх R, але:

1. Нингидринова реакція стає негативною, т.к. за винятком N- та C-кінцевих, α-аміно- та α-карбоксигрупи витрачаються на утворення пептидних зв'язків. Позитивна нінгідринова реакція з білком, швидше свідчить про присутність домішок амінокислот у препараті чи посуді.

2. Для всіх пептидів та білків специфічна біуретова реакція на пептидну групу, яка відсутня в мономерних амінокислотах.

3. З більш специфічних реакцій на R амінокислот, бувають корисні: ксантопротеїнова реакція з концентрованою азотною кислотою, на ароматичні R Фен, Тир, Три; реакція з ізатином на п'ятичленний цикл Про, а також реакції на імідазольний R Гіс, тіогрупу Цис та гуанідиногрупу Арг. Важливо враховувати, що частина цих R прихована всередині білкових глобул і тому якісні реакції на них ослаблені. Тому, перед проведенням, білки зазвичай денатурують тим чи іншим способом.

4. На відміну від істинних розчинів амінокислот, колоїдним розчинам білків властиві осадові реакції, пов'язані з руйнуванням їх гідратних оболонок і, внаслідок цього, зниженням їх розчинності під дією водовіднімних засобів: нейтральних солей = висолення, метанолу = МеОН, етанолу = EtОН, ацетону, сечовини та ін агентів.

Виконуючи якісні реакції, слідує:

1. Ретельно дотримуватись правил пожежної безпеки та робіт з концентрованими кислотами та лугами = ЄЖ.

2. Промаркувати склографом або фломастером 2 ряду пробірок і помістити в один з них не більше 0,5 мл (2-5 крапель) 1% розчину амінокислоти, а в іншій приблизно той же обсяг 1% розчину білка.

3. У пару пробірок з розчинами амінокислоти та білка, паралельно додати по 3-5 крапель відповідних реактивів і провести інші процедури, зазначені для відповідної реакції.

4. При необхідності нагрівання пробірок – зняти кришку тигля та підпалити сірником сухе пальне. Потім затиснути пробірку в тримач, примітивна конструкція якого дуже ненадійна. Тому краще обернути пару пробірок складеним у смужку листком паперу і, притримуючи їх великим пальцем, поступово пропускати нижні половини пробірок через полум'я, уникаючи напряму шийок на сусідів та бурхливого закипання розчину. Виконавши операцію, своєчасно погасити полум'я кришкою тигля.

5. Результати дослідів, відповідно до шаблону, оформлювати на розвороті лабораторного зошитау вигляді таблиці:

6. Обміркувавши отримані результати та, завершивши оформлення протоколу, разом зі штативом пробірок, пред'явити їх викладачеві для захисту.

1. Нінгідринова реакція.Заснована на дезамінуванні та декарбоксилюванні α-амінокислот спиртовим розчином нінгі-дріна:

Аміак, що реагує з двома молекулами нінгідрину, утворює пофарбоване похідне, з максимумом поглинання при 540 нм (для Про - 440 нм).

Хід роботиДо досліджуваних зразків додати по 3-5 крапель 0,5% спиртового розчину нінгідрину. Пробірки із сумішами акуратно прогріти на полум'ї та через 2-3 хв зареєструвати появу забарвлення.

2. Ксантопротеїнова реакція.Як уже сказано вище, заснована на утворенні нітропохідних амінокислот з ароматичним R: Фен, Тир, Три.

Хід роботи: Включивши тягу витяжної шафи, в пару пробірок з досліджуваними розчинами обережно додати кілька крапель концентрованої азотної кислоти (HNO 3). Пробірки акуратно прогріти на полум'ї, уникаючи напряму шийок на сусідів, та зареєструвати розвиток забарвлення.

3. Нітропрусидна реакція.Заснована на лужному гідролізі сірковмісної амінокислоти цистеїну, з виділенням сульфіду натрію (Na 2 S), що дає зі свіжоприготованим розчином нітропрусиду натрію, комплекс червоного кольору.

Хід роботи:В обидві пробірки з 5-10 крапель досліджуваних розчинів додати рівний обсяг 20% їдкого натру і прокип'ятити не менше 3-5 хв. Додати в пробірки по 3-5 крапель розчину нітропрусиду натрію та зафіксувати розвиток забарвлення.

4. Біуретова реакція.Заснована на освіті в лужному середовищі кольорового комплексу пептидного зв'язку з іоном Cu2+. Служить універсальним тестом виявлення пептидів і білків в розчинах. Оскільки зі зростанням кількості пептидних зв'язків, інтенсивність фарбування розчину лінійно наростає, широко застосовується для фотометричного визначення концентрацій білка.

Хід роботи. У пробірки з 5-10 краплями досліджуваних розчинів додати стільки ж 10% розчину їдкого натру. Добре перемішати та додати по 2 краплі 1% розчину сульфату міді (CuSO 4). Проби перемішати і за кілька хвилин зареєструвати розвиток забарвлення.

5. Проба із кип'ятінням.Заснована на тепловій денатурації білків.

Хід роботи. Обидві пробірки з досліджуваними розчинами підкислити, не більше однієї краплі 1 % розчину оцтової кислоти (AcOH) і нагріти до кипіння. Прокип'ятив розчини 2-3 хв, зареєструвати результати та пояснити механізм явища.

6. Осадження солями важких металів(Ме) . Їхні денатуруючі властивості засновані на здатності катіонів важких Ме реагувати з функціональними групами R молекули білка: тіо-, аміно-, карбокси-, ароматичними. Також їх сильні аніони викликають перезарядку іоногенних груп у молекулах білків, руйнуючи в них тим самим іонні зв'язки.

Хід роботи. В обидві пробірки з досліджуваними розчинами додати кілька крапель 5 % розчину сульфату міді (CuSO 4). Зареєструвати та пояснити отримані результати.

7. Осадження органічними кислотами.Засновано на кислотній денатурації білків та утворенні ковалентних похідних тіо-, аміно- та ароматичних груп R амінокислот з хлорорганікою.

Хід роботи. У пробірки з досліджуваними розчинами додати кілька крапель 10 % розчину трихлороцтової кислоти (ТХУ) і, за кілька хвилин зареєструвати результати

У цій статті будуть розглянуті методи визначення амінокислот, що застосовуються не тільки при аналізі продуктів, а й у біохімії та фармацевтичному аналізі.

Загальна кількість амінокислот може бути проведена фотометричним методом, заснованим на визначенні аміаку, отриманого з амінокислот методом К'єльдаля.

Реакція з 1-нафтолом. Для визначення аргініну, гістидину, тирозину запропоновано реакцію з 1-нафтолом. У присутності гіпохлориту натрію (NaOCl) розчин забарвлюється червоного кольору. Пробу розчину 50% етанолі, що містить амінокислоту, охолоджують льодом і додають 10% розчин NaOCl і розчин нафтола. Продукт реакції пофарбований у червоний колір (max = 550 нм). За інтенсивністю забарвлення отриманого розчину визначають вміст амінокислот.

Біуретова реакція. Однією з найважливіших реакцій, використовуваних визначення амінокислот, є биуретовая реакція. Реакція здійснюється додаванням до лужного розчину біурету розведеного водного розчину солі міді (II). При цьому розчин забарвлюється в інтенсивний фіолетовий колір завдяки утворенню комплексної сполуки.

У біуретову реакцію вступають сполуки, що містять не менше 2-х амідних угруповань або аміногідроксіетиленову групу, а також аміди та іміди амінокислот. Цю реакцію дають білки та концентровані розчини амінокислот та амідів. Розведені розчини амінокислот не дають біуретової реакції і тому реакцію можна використовувати для встановлення кінця гідролізу білка. Реакцію застосовують також для якісного та кількісного визначення білка. На біуретовій реакції засновані методики визначення білка в крові та інших біологічних рідинах, що використовуються в клініко-діагностичних лабораторіях.

Нінгідринова реакція. Другий найважливішою реакцією, використовуваної визначення амінокислот, є нингидриновая реакція – кольорова реакція на a-амінокислоти, яку здійснюють нагріванням останніх у лужному розчині надлишку нінгідрину.

Нінгідрин здійснює окисне декарбоксилювання a-амінокислот з утворенням аміаку, вуглекислого газу та альдегіду, що містить на один атом вуглецю менше, ніж вихідна амінокислота. Відновлений нінгідрин далі реагує з аміаком, що вивільнився, і другою молекулою нінгідрину, утворюючи з аміаком пофарбований продукт конденсації.

З'єднання (пігмент), що утворюється, має фіолетово-блакитне забарвлення (l мах = 570 нм). Утворення цієї забарвленої сполуки використовується в кількісному тесті на a-амінокислоти, за допомогою якого можна виявити амінокислоти, навіть їх кількість не перевищує 1 мкг.

Пролін та гідроксипролін, у яких немає a-аміногрупи, у реакції з нінгідрином утворюють похідні жовтого кольору (l мах = 440 нм). Реакція специфічна, т.к. пофарбований продукт з нінгідрин дають також аміак і сполуки, що містять аміногрупу (аміни, білки, пептиди). Однак з цими сполуками не виділяється CO2. Виділення вуглекислого газу характерне лише для a-амінокислот. Реакція використовується для колориметричного кількісного визначення a-амінокислот, у тому числі в автоматичних амінокислотних аналізаторах (вимір обсягу 2).

Нінгідринова реакція використовується для визначення гліцину, ізолейцину, лейцину; менш інтенсивне забарвлення дають серин, фенілаланін, цистеїн, тирозин, триптофан та ін.

Продукти, що утворюються, характеризуються досить інтенсивним забарвленням (e = 1,8–3,3·10 4 ), але пофарбовані продукти нестабільні. Інтенсивність фарбування швидко зменшується. Для стабілізації додають CdCl 2 . Він утворює стійкі комплекси з сполуками, що утворюються. Хлорид кадмію також прискорює реакцію.

Амінокислоти та деякі інші сполуки, що містять аміногрупу, конденсуються в лужному середовищі з 1,2-нафтохінон – 4-сульфоксилотою з утворенням пофарбованих у червоний, жовтий, помаранчевий колір похідних 1,2-нафтохінонмоноіміну.

Реакція використовується для визначення a-аміноксилот (валін, ізолейцин, лейцин та ін.).

Для визначення триптофану може бути використана реакція з 4-диметиламінобензальдегідом. Продукт реакції забарвлений у фіолетовий колір і за інтенсивністю забарвлення визначають вміст триптофану в аналізованому розчині.

Слід зазначити, що дана реакція в аналізі харчових продуктів використовується рідко.

Для кількісного визначення амінокислот, що містять сірку, використовується броматометричний метод, що ґрунтується на наступній реакції:

Розчин цистеїну в 1% розчині NaOH вливають у колбу з притертою пробкою, додають 0,1 н. розчин бромату калію, сухий бромід калію і підкислюють 10% HCl.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Бром, що утворюється в результаті реакції, кількість якого еквівалентна кількості бромату калію, реагує з амінокислотою. Через 10 хв додають йодид калію, який вступає в реакцію з бромом, що не прореагував, і титрують йод, що виділився 0,1 н. розчином тіосульфату натрію з крохмалем як індикатор.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

Кількість тіосульфату, що пішов на титрування, еквівалентна кількості брому, який не вступив у реакцію з амінокислотою. За різницею між кількістю доданого бромату калію та тіосульфату знаходять кількість брому, що пішов на реакцію з амінокислотою, а отже, і кількість амінокислоти.

Метіонін визначають аналогічно. Метіонін при цьому окислюється до сульфону:

Ця реакція за певних умов дозволяє дуже точно визначити зміст метіоніну.