Методи ведення культур клітин. Клітинні культури
Залежно від техніки приготування культури клітин класифікують на:
- одношарові- Клітини здатні прикріплюватися і розмножуватися на поверхні хімічно нейтрального скла або пластику.
- суспензійні- Клітини розмножуються у всьому обсязі живильного середовища при її перемішуванні.
- органні- цілісні шматочки органів і тканин, що зберігають вихідну структуру поза організмом (застосування обмежене).
Найбільшого поширення мають одношарові культури клітин, які можна розділити в залежності від числа життєздатних генерацій на
1) первинні (первинно трипсинізовані),
2) напівперевиваються (диплоїдні)
3) перевиваються.
За походженнямвони класифікуються на ембріональні, пухлинні та з дорослих організмів.
По морфогенезу- на фібробластні, епітеліальні та ін.
Первиннікультури клітин - це клітини будь-якої тканини людини або тварини, які мають здатність рости у вигляді моношару на пластмасовій або скляній поверхні, покритій спеціальним живильним середовищем. Термін життя таких культур обмежений. У кожному конкретному випадку їх одержують із тканини після механічного подрібнення, обробки протеолітичними ферментами та стандартизації кількості клітин. Первинні культури, отримані з бруньок мавп, бруньок ембріона людини, амніону людини, курячих ембріонів, широко використовуються для виділення та накопичення вірусів, а також для виробництва вірусних вакцин.
Напівперевиваються(або диплоїдні ) культури клітин - клітини одного типу, здатні in vitro витримувати до 50-100 пасажів, зберігаючи у своїй свій вихідний диплоїдний набір хромосом. Диплоїдні штами фібробластів ембріона людини використовуються як для діагностики вірусних інфекцій, так і для виробництва вірусних вакцин. Найчастіше використовують культури фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, IMR-9), корів, свиней, овець тощо.
Перевиваютьсяклітинні лінії характеризуються потенційним безсмертям та гетероплоїдним каріотипом. Джерелом ліній, що перевиваються, можуть бути первинні клітинні культури(наприклад, СОЦ – серце мавпи цинамобус, ПЕМ – нирки ембріона свині, ВНК-21 – з нирок одноденних сирійських хом'яків; ПМС – з нирки морської свинки, Vero – нирка зеленої мавпи та ін.) окремі клітини яких виявляють тенденцію до нескінченного розмноження in vitro. Сукупність змін, що призводять до появи з клітин таких особливостей, називають трансформацією, а клітини тканинних культур, що перевиваються, - трансформованими. Іншим джерелом клітинних ліній, що перевиваються, є злоякісні новоутворення. І тут трансформація клітин відбувається in vivo. Найбільш часто у вірусологічній практиці застосовуються такі лінії клітин, що перевиваються: HeLa - отримана з карциноми шийки матки; Нер-2 – з карциноми гортані; Детройт-6 – з метастазу раку легені у кістковий мозок; RH – з нирки людини, КВ – карцинома ротової порожнини, RD – рабдоміосаркома людини.
Культури органів– являють собою приготовлені у стерильних умовах зрізи органів тварин, які протягом певного терміну (дні, тижні) зберігають свою життєдіяльність в особливих умовах культивування.
Клітинні культурице генетично однорідні популяції клітин, що ростуть у постійних умовах довкілля. Це можуть бути штами нормальних клітин людини, тварин, рослин чи тканин злоякісних пухлин.
Умови культивування
Клітини зазвичай поміщають у скляні судини, звідси й дослідження одержали назву вивчення in vitro (від латів. In - в, vitro - скло), хоча тепер частіше культури вирощують у пластмасових судинах. Виділені з тканин клітини інкубують при температурі 38 ° C 39 ° C (для клітин тваринного та людського організмів) та при 22 ° C 28 ° C (для рослинних клітин) у живильному середовищі відповідного складу. Клітини тоді ростуть у вигляді суспензії чи моношару. Суспензійна культура - це вирощування окремих клітин або невеликих їх груп у зваженому стані в рідкому живильному середовищі з використанням апаратури, що забезпечує їхню аерацію та перемішування. Характерною особливістю суспензійних культур є їхня морфологічна та біохімічна гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняються за розміром та формою.
Застосування
Застосування у цитології
У цитології цей спосіб зручний тим, що клітини в культурі легко доступні для різних біохімічних маніпуляцій. Працюючи з ними радіоактивні речовини, отрути, гормони та інших. можуть бути введені у потрібній концентрації протягом необхідного часу. Кількість цих речовин може бути значно меншою, ніж при експерименті на тваринах. Зникає загроза того, що речовина буде метаболізована печінкою, екскретуватиметься нирками або відкладеться в м'язах. Це забезпечує отримання реальних значень швидкості дії речовини на клітину або засвоєння її клітиною.
Для дослідження живих рослинних клітин використовують культуру ізольованих протопластів. Ізольовані протопласти можна визначити як «голі» клітини рослин, оскільки клітинна стінка видаляється механічним чи ферментативним способом. Система ізольованих протопластів дає можливість вести селекцію на клітинному рівні, працювати в малому обсязі з великою кількістю індивідуальних клітин, одержувати нові форми рослин шляхом прямого перенесення генів, одержувати соматичні гібриди між віддаленими у систематичному відношенні видами. Оскільки в ізольованих протопластах відразу починається регенерація клітинної оболонки, то є зручним об'єктом для вивчення формування целюлозних мікрофібрил.
Застосування у вірусології
У вірусології культури клітин використовують дуже широко, оскільки із нею порівняно легко працювати у лабораторії, на відміну інших методів — вирощування вірусів на курячих ембріонах чи організмі живих тварин. Крім того, на моношарі клітинної культури можна добре вивчити цитопатичну дію вірусів, за утворенням внутрішньоклітинних включень, бляшок, у реакціях гемадсорбції та гемагглютинації та за колірною пробою. p align="justify"> При роботі з культурами клітин істотні результати можуть бути отримані при роботі з невеликою кількістю культур. Експерименти, які вимагають для підтвердження того чи іншого факту, сотні або тисячі лабораторних тварин можуть бути з рівною статистичною достовірністю поставлені на такій же кількості культур клітин. Таким чином, при лабораторії не треба тримати віварій і відсутні етичні аспекти поводження з хворими тваринами.
Також вивчається трансформація клітин вірусами, механізм якої подібний до механізму виникнення злоякісних пухлин.
Застосування у фармакології
Культури клітин широко застосовуються для тестування дії речовин, які можуть бути використані як лікарські препарати. Незважаючи на те, що результати, отримані на культурах клітин не можна екстраполювати на весь організм, не викликає сумніву, що якщо та чи інша речовина порушує діяльність клітин з кількох різних ліній культур, то слід очікувати негативного ефекту і при введенні цієї речовини в організм.
Застосування у біотехнології
Специфічні культури клітин є цінним джерелом гормонів та інших біологічно активних речовин. Вже зараз вони застосовуються для противірусного білка інтерферону.
Застосування у генетиці
У генетиці здатність клітин до зростання культури використовується в наступних напрямках:
- Клонування
- Зберігання клітин
- Отримання мутантних клітин та робота з ними
Типи культур клітин
1. Первинно-трипсинізовані - отримують із подрібнених тканин людини та тварин шляхом їх обробки трипсином або іншими ферментами. Витримують лише 5-10 поділів (пасажів).
2. перевиваються - клітини, які набули здатності до безмежного розмноження, оскільки є похідними пухлин людини та тварин.
3. Напівперещеплювані (диплоїдні) - можуть витримувати до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом.
Найбільш поширені лінії клітин
| Лінія клітин | Розшифровка скорочення | Організм | Тканина | Морфологія | Примітки та посилання | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 293-T | людина | нирка (ембріональна) | Похідна HEC-293 ECACC | |||
| 3T3 cells | "3-day transfer, inoculum 3 x 105 cells" | миша | ембріональні фібробласти | Відома також як NIH 3T3 ECACC | ||
| 721 | людина | меланома | ||||
| 9L | щур | гліобластома | ||||
| A2780 | людина | яєчник | рак яєчника | ECACC | ||
| A2780ADR | людина | яєчник | похідне A2780 з резистентністю до адріаміцину. | ECACC | ||
| A2780cis | людина | яєчник | похідне A2780 з резистентністю до цисплатину | ECACC | ||
| A172 | людина | гліобластома | злоякісна гліома | ECACC | ||
| A431 | людина | шкіряний епітелій | плоскоклітинна карцинома | ECACCCell Line Data Base | ||
| A-549 | людина | карцинома легень | епітелій | DSMZECACC | ||
| B35 | щур | нейробластома | ATCC | |||
| BCP-1 | людина | периферичні лейкоцити | HIV + лімфома | ATCC | ||
| BEAS-2B | bronchial epithelium + adenovirus 12-SV40 virus hybrid (Ad12SV40) | людина | легені | епітелій | ATCC | |
| bEnd.3 | brain endothelial | миша | кора головного мозку | ендотелій | ATCC | |
| BHK-21 | "Baby Hamster Kidney" | хом'як | нирка | фібробласти | ECACCOlympus | |
| BR 293 | людина | молочна залоза | рак | |||
| BxPC3 | Biopsy xenograph of pancreatic carcinoma line 3 | людина | панкреатична аденокарцинома | епітелій | ATCC | |
| C3H-10T1/2 | миша | ембріональні мезенхімальні клітини | ECACC | |||
| C6/36 | комар | тканини личинки | ECACC | |||
| CHO | Chinese hamster ovary | Cricetulus griseus | яєчник | епітелій | ECACCICLC | |
| COR-L23 | людина | легені | ECACC | |||
| COR-L23/CPR | людина | легені | ECACC | |||
| COR-L23/5010 | людина | легені | ECACC | |||
| COR-L23/R23 | людина | легені | епітелій | ECACC | ||
| COS-7 | Cercopithecus aethiops, origin-defective SV-40 | мавпа Cercopithecus aethiops | нирка | фібробласти | ECACCATCC | |
| CML T1 | Chronic Myelod Leukaemia T-lymphocyte 1 | людина | хронічна мієлоїдна лейкемія | T-клітинна лейкемія | Blood | |
| CMT | canine mammary tumor | собака | молочна залоза | епітелій | ||
| D17 | собака | остеосаркому | ECACC | |||
| DH82 | собака | гістіоцитоз | моноцити / макрофаги | ECACC | ||
| DU145 | людина | карцинома | простата | |||
| DuCaP | Dura mater Cancer of the Prostate | людина | епітелій | 11317521 | ||
| EL4 | миша | T-клітинна лейкемія | ECACC | |||
| EMT6/AR1 | миша | молочна залоза | епітелій | ECACC | ||
| EMT6/AR10.0 | миша | молочна залоза | епітелій | ECACC | ||
| FM3 | людина | метастази у лімфатичний вузол | меланома | |||
| H1299 | людина | легені | рак | |||
| H69 | людина | легені | ECACC | |||
| HB54 | Гібридому | Гібридому | секретує L243 mAb (проти HLA-DR) | Human Immunology | ||
| HB55 | Гібридому | Гібридому | секретує MA2.1 mAb (проти HLA-A2 та HLA-B17) | Journal of Immunology | ||
| HCA2 | людина | фібробласти | Journal of General Virology | |||
| HEK-293 | людський embryonic kidney | людина | нирка (ембріональна) | епітелій | ATCC | |
| HeLa | Henrietta Lacks | людина | рак шийки матки | епітелій | DSMZECACC | |
| Hepa1c1c7 | clone 7 of clone 1 hepatoma line 1 | миша | гепатома | епітелій | ECACC | |
| HL-60 | human leukemia | людина | мієлобласти | клітини крові | ECACCDSMZ | |
| HMEC | human mammary epithelial cell | людина | епітелій | ECACC | ||
| HT-29 | людина | епітелій товстого кишечника | аденокарцинома | ECACC Cell Line Data Base |
||
| Jurkat | людина | T-клітинна лейкемія | білі клітини крові | ECACC | ||
| JY | людина | лімфобласти | В-клітини, іморталізовані EBV | |||
| K562 | людина | лімфобласти | ECACC | |||
| Ku812 | людина | лімфобласти | еритролейкемію | ECACC | ||
| KCL22 | людина | лімфобласти | хронічною мієлоїдною лейкемією | |||
| KYO1 | Kyoto 1 | людина | лімфобласти | хронічною мієлоїдною лейкемією | DSMZ | |
| LNCap | Lymph node Cancer of the Prostate | людина | аденокарцинома простати | епітелій | ECACCATCC | |
| Ma-Mel 1, 2, 3 … .48 | людина | лінії клітин меланоми | ||||
| MC-38 | миша | аденокарцинома | ||||
| MCF-7 | Michigan Cancer Foundation-7 | людина | молочна залоза | інвазивна карцинома проток молочної залози | ER+, PR+ | |
| MCF-10A | Michigan Cancer Foundation | людина | молочна залоза | епітелій | ATCC | |
| MDA-MB-231 | людина | молочна залоза | рак | ECACC | ||
| MDA-MB-468 | MD Anderson - Metastatic Breast | людина | молочна залоза | рак | ECACC | |
| MDA-MB-435 | MD Anderson - Metastatic Breast | людина | молочна залоза | меланома або карцинома (одна думка відсутня) | Cambridge Pathology ECACC | |
| MDCK II | Madin Darby canine kidney | собака | нирка | епітелій | ECACC ATCC | |
| MOR/0.2R | людина | легені | ECACC | |||
| NCI-H69/CPR | людина | легені | ECACC | |||
| NCI-H69/LX10 | людина | легені | ECACC | |||
| NCI-H69/LX20 | людина | легені | ECACC | |||
| NCI-H69/LX4 | людина | легені | ECACC | |||
| NIH-3T3 | National Institutes of Health, 3-денний transfer, inoculum 3 x 10 травень cells | миша | ембріон | фібробласти | ECACCATCC | |
| NALM-1 | периферична кров | хронічною мієлоїдною лейкемією | Cancer Genetics and Cytogenetics | |||
| NW-145 | меланома | ESTDAB | ||||
| OPCN/OPCT | Onyvax Prostate Cancer …. | лінії клітин раку простати | Asterand | |||
| Peer | людина | T-клітинна лейкемія | DSMZ | |||
| PNT-1A / PNT 2 | лінії клітин раку простати | ECACC | ||||
| RenCa | Renal Carcinoma | миша | карцинома нирки | |||
| RIN-5F | миша | підшлункова залоза | ||||
| RMA / RMAS | миша | T-клітинний рак | ||||
| Saos-2 | людина | остеосаркому | ECACC | |||
| Sf-9 | Spodoptera frugiperda | метелик Spodoptera frugiperda | яєчник | DSMZECACC | ||
| SkBr3 | людина | карцинома молочної залози | ||||
| T2 | людина | Гібридому В-клітин та Т-клітинної лейкемії | DSMZ | |||
| T-47D | людина | молочна залоза | карцинома проток | |||
| T84 | людина | карцинома товстого кишечника / метастази у легені | епітелій | ECACCATCC | ||
| THP1 | людина | моноцити | гострий мієлоїдний лейкоз | ECACC | ||
| U373 | людина | гліобластома-астроцитома | епітелій | |||
| U87 | людина | гліобластома-астроцитома | епітелій | Abcam | ||
| U937 | людина | лейкемічна моноцитарна лімфома | ECACC | |||
| VCaP | Vertebra Prostate Cancer | людина | метастатичний рак простати | епітелій | ECACC ATCC | |
| Vero | "Vera Reno" / "Vero" ("істина") | африканська зелена мавпа | епітелій нирки | ECACC | ||
| WM39 | людина | шкіра | первинна меланома | |||
| WT-49 | людина | лімфобласти | ||||
| X63 | миша | меланома | ||||
| YAC-1 | миша | лімфома | Cell Line Data Base ECACC | |||
| YAR | людина | B-лімфоцити | трансформовані EBV | Human Immunology |
Надіслати свою гарну роботу до бази знань просто. Використовуйте форму нижче
Студенти, аспіранти, молоді вчені, які використовують базу знань у своєму навчанні та роботі, будуть вам дуже вдячні.
Розміщено на http://www.allbest.ru/
клітина вірус культура
Вступ
1. Види культур клітин
2. Поживні середовища
4.1 Виявлення вірусів
Список літератури
Вступ
Для кількісного накопичення вірусів найбільш зручну систему представляють культури клітин. Перші спроби культивування клітин тварин поза організмом відносяться до кінця минулого століття. Ці уривчасті спостереження вказували на можливість збереження життєздатності тканин і клітин у штучних умовах і започаткували глибокі наукові дослідження тканинних культур.
Велика заслуга у справі розробки методів культивування тканин належить Карелю Він уперше довів можливість розмноження клітин тварин у штучних умовах і тим самим продемонстрував їхню «безсмертність» і подібність з одноклітинними вільноживучими організмами. Значних успіхів у цьому напрямі досягла група дослідників під керівництвом Ерла. Вони перші отримали зростання великої кількості клітин на склі і в рідкій суспензії, що перемішується. Поява антибіотиків та успіхи у створенні штучних поживних середовищ відкрили нову еру у розвитку методів тканинних культур.
Тканинні культури давно знайшли застосування для вирішення різноманітних питань біології та медицини. Однак лише успіхи в галузі вірусології, досягнуті за допомогою тканинних культур, стали потужним стимулом їх розвитку до сучасного рівня.
Культивування вірусів допомагає вирішити низку теоретично проблем, пов'язаних із вивченням особливостей взаємодії "вірус-клітина". Крім того рішення цілого ряду прикладних завдань, пов'язаних з діагностикою та виробництвом препаратів для профілактики вірусних інфекцій неможливе без накопичення сировини, що містить вірус.
1. Види культур клітин
Перенесення клітин цілісного організму в умови життя in vitro припиняє їх існування як одного з численних структурних елементів тканини або органу, до складу яких вони раніше входили. При цьому клітини виходять з-під контролю нейро-гуморальних факторів і набувають ряду особливостей, що залежать як від самого факту відторгнення клітин від цих тканин, так і від конкретних умов їх існування in vitro.
Клітини або тканини, що живуть поза організмом, характеризуються цілим комплексом метаболічних, морфологічних і генетичних рис, різко відмінних від властивостей клітин органів і тканин in vivo.
Залежно від методики первинної експлантації тканини і техніки її культивування розрізняють кілька видів культур, що переживають і ростуть, тканин і клітин. Найбільшого поширення мають одношарові, і навіть суспензійні культури зростаючих клітин. Саме вони становлять основу сучасної лабораторної та виробничої вірусологічної практики.
Розрізняють два основні види одношарових клітинних культур: первинні та перевиваються.
Терміном "первинна" позначають клітинну культуру, отриману безпосередньо з тканин людини або тварин в ембріональному або постнатальному періоді. Термін життя таких культур обмежений. Після певного часу в них виникають явища неспецифічної дегенерації, що виражається в грануляції та вакуолізації цитоплазми, округленні клітин, втрати зв'язку між клітинами та твердим субстратом, на якому вони вирощувалися. Періодична зміна середовища, зміна складу останньої та інші процедури можуть лише трохи збільшити терміни життя первинної клітинної культури, але не можуть запобігти її кінцевій деструкції та загибелі. Цілком ймовірно, що цей процес пов'язаний з природним згасанням метаболічної активності клітин, виведених з-під контролю нейро-гуморальних факторів, що діють в цілісному організмі.
Лише окремі клітини або групи клітин популяції на тлі дегенерації більшої частини клітинного пласта можуть зберегти здатність до зростання та розмноження. Ці клітини, виявивши потенцію нескінченного розмноження in vitro, при багаторазових перевивках дають початок культурам клітин, що перевиваються.
Розрізняють лінії і штами клітин, що перевиваються. Першим терміном позначають клітини, що перевиваються, характеризуються потенційним безсмертям і, як правило, гетероплоїдним каріотипом другим терміном - напівперевиваються клітини з диплоїдним набором хромосом і обмеженою тривалістю життя in vitro. Поява і тих, і інших клітин пов'язане з процесом відбору в клітинній популяції первинних культур, що є, таким чином, джерелом всіх ліній і штамів клітин, що перевиваються.
Основна перевага ліній клітин, що перевиваються, порівняно з будь-якою первинною культурою, полягає в потенції необмеженого розмноження поза організмом і відносної автономності зближує їх з бактеріями і одноклітинними найпростішими.
Здатність клітин, що перевиваються, до нескінченного розмноження in vitro знаменує собою якісний стрибок, в результаті якого клітини набувають здатності до автономного існування, подібно до мікроорганізмів, що вирощуються на штучних живильних середовищах. Сукупність змін, що призводять до появи у клітин таких особливостей, називають трансформацією, а клітини тканинних культур, що перевиваються, - трансформованими.
Удосконалення техніки культивування клітин значно розширило можливості отримання клітинних ліній, що перевиваються, з найрізноманітніших тканин тварин і людини. При цьому не було виявлено вікову межу, вище якої тканини втрачали здатність адаптації до необмеженого зростання in vitro, тобто. до трансформації.
Іншим джерелом клітинних ліній, що перевиваються, є злоякісні новоутворення. У цьому випадку трансформація клітин відбувається in vivo внаслідок розвитку патологічного процесу, етіологія якого багато в чому залишається нез'ясованою.
Не всі злоякісні новоутворення здатні давати початок клітинам, що перевиваються, культурним. Так, наприклад, безуспішними були спроби отримати клітини, що перевиваються, з ракових пухлин шлунка і молочних залоз людини. Насилу вдається адаптувати до життя in vitro клітини плоскоклітинного раку шкіри та слизових. З іншого боку, порівняно легко виводяться лінії із тканин сарком та злоякісних пухлин нервової системи.
2. Поживні середовища
У будь-якій клітинній культурі розрізняють клітинну та рідку фази. Рідка фаза забезпечує життєдіяльність клітин культури та є поживними середовищами різного складу та властивостей.
Усі середовища за своїм призначенням поділяються на ростові та підтримуючі. У складі ростових середовищ повинно бути більше поживних речовин, щоб забезпечити активне розмноження клітин для формування моношару на поверхні скла або досить високу концентрацію клітинних елементів у суспензії (при отриманні суспензійних культур). Підтримуючі середовища фактично повинні забезпечувати лише переживання клітин у сформованому моношарі при розмноженні в клітинах вірусних агентів.
Ростові та підтримуючі середовища багатокомпонентні. До їх складу можуть входити як природні продукти (амніотичні рідини, сироватки тварин), так і субстрати, отримані в результаті часткової обробки природних продуктів (ембріональні екстракти, лактальбуміну гідролізат, гемогідролізат, амінопептид і т. д.), а також синтетичні хімічно чисті речовини (Амінокислоти, вітаміни, солі).
Як приклад живильного середовища, що повністю складається з природних компонентів, можна назвати середовище Баклі, запропоноване для вирощування клітинних культур із ниркового епітелію мавп. У цю середу входить коров'яча амніотична рідина (85%), кінська сироватка (10%) та коров'ячий ембріональний екстракт (5%).
Усі природні продукти малостандартні, їх використання пов'язане з великою небезпекою мікробної та вірусної контамінації клітинних культур. У зв'язку з цим відбувається поступове витіснення їх синтетичними стандартними сумішами. Найбільше застосування знаходять синтетичне середовище 199 та середовище Голка. Широко використовуються середовища, що містять строго певні кількості солей, амінокислот та вітамінів.
Незалежно від призначення, всі поживні середовища для тканинних культур конструюються на основі будь-якого збалансованого сольового розчину з достатньою буферною ємністю. Найчастіше ними є розчини Хенкса та Ерла. Ці розчини - обов'язковий компонент будь-якого живильного середовища. Невід'ємним компонентом більшості ростових середовищ є сироватка тварин (теляча, бичача, кінська), без наявності 5-10% якої розмноження клітин та формування моношару не відбувається.
Включення сироватки водночас перешкоджає створенню ростових середовищ точного хімічного складу, дуже важливих у розвиток фундаментальних досліджень з клітинної фізіології, оскільки разом із сироваткою (чи її дериватами) вводиться цілий комплекс неконтрольованих чинників, варіюючих залежно від серії сироватки.
У 50-ті роки Ewans та Waymouth були запропоновані безсироваткові середовища точного хімічного складу. Однак ці середовища не забезпечували показників проліферативної активності клітин, які зумовлюють середовища з додаванням сироваток. У зв'язку з цим цікава робота Birch і Pirt, які показали, що з забезпечення інтенсивного зростання клітин у безсироваткових середовищах визначальним є включення сірчанокислих солей Fe, Zn, Cu, і навіть МnС1 2 .
У ростові живильні середовища, а також буферний розчин для промивання тканин додають антибіотики. Їх вводять у середу безпосередньо перед вживанням із розрахунку 1 мл основного розчину антибіотиків на 500 мл середовища.
Нижче наведено склад і метод приготування одного з найпоширеніших поживних середовищ.
Середа Голка
л-аргініну - 17,4
л-цистину - 4,8
л-гістидину - 3,1
л-ізолейцину - 26,2
л-лейція - 13,1
л-лізину - 14,6
л-метіоніну - 7,5
л-фенілаланіну - 8,3
л-треоніну - 11,9
л-триптафану - 2,0
л-тирозину - 18,1
л-валіна – 11,7
біотину - 0,24
холіну - 0,12
холін-хлориду - 0,14
вітаміну В 12 (птероілглютамінової кислоти) - 0,44
нікотинаміду - 0,12
пантотенової кислоти - 0,22
пантотенату кальцію – 0,48
піридоксалю (піридоксин хлоргідрату) - 0,20
тіамін-хлоргідрату - 0,34
рибофлавіну - 0,04
хлористого натрію – 5850,0
хлористого калію – 373,0
фосфату натрію однозаміщеного (NaH 2 PO 4 . Н 2 Про) - 138,0
кальцію хлористого - 111,0
двовуглекислого натрію (NaHCO 3) – 1680,0
магнію хлористого (MgCl 2 . 6Н 2 Про) - 102,0
глюкози – 900,0
л-глутаміну - 146,2-292,3
пеніциліну - 50,0
стрептоміцину – 50,0
фенолу червоного – 5,0
води до 1000,0
Приготування.
Розчин 1. 500 мл води, нагрітої приблизно до 80°, помішуючи, розчиняють зазначені вище кількості амінокислот, після чого додають л-глютамін і фенол-червоний.
Розчин 2. 100,0 мл води розчиняють неорганічні солі, за винятком двовуглекислого натрію (NaHCO 3), змішують з попереднім розчином неорганічних солей і додають біотин і вітамін B 12 .
Розчин 3. У 200,0 мл води розчиняють усі вітаміни, крім біотину та птеро-ілглютамінової кислоти, та антибіотики - пеніцилін та стрептоміцин. Всі розчини стерилізують фільтруванням через скляний фільтр-нутч (пориста скляна пластина, величина пір 0,7-1,5) або через азбестоцелюлозні пластини Зейтца після попереднього промивання водою, а потім - приготованим розчином.
500 мл розчину 1+200 мл розчину 2+200 мл розчину 3 змішують і доводять стерильною водою до 1000,0 мл. Можна додати 1 мг інозиту на 1 л.
3. Отримання клітинних культур
3.1 Приготування первинних клітинних культур
Первинною - називається культура, отримана з тканини і що вирощується in vitro до початку субкультивування, тобто до першого посіву. Первинна культура позбавлена багатьох клітин, присутніх у вихідній тканині, оскільки не всі клітини здатні прикріплюватися до субстрату та вижити in vitro. У процесі культивування клітин відбувається відносне збіднення культури клітинами, що не діляться або повільно діляться.
На першому етапі отримання первинної культури проводять стерильне видалення фрагмента тканини, органа тварини та її механічну або ферментативну дезагрегацію. Тканина подрібнюється до шматочків об'ємом до 1 – 3 мм, шматочки тканини відмиваються від еритроцитів розчином Хенкса з антибіотиками. Для дезагрегації тканини використовують трипсин (0,25% неочищений або 0,01-0,05% очищений) або колагеназу (200-2000 од/мл, неочищена) та інші протеолітичні ферменти. Такий спосіб одержання культури забезпечує високий вихід клітин.
Первинні культури можуть бути отримані від шматочків тканини, об'ємом 1 мм, які прикріплюються до поверхні субстрату завдяки власної адгезивності або наявності насічок на чашці, або за допомогою згустку плазми. У цих випадках відбуватиметься зростання клітин із фрагментів. Клітини, які мігрують з експлантатів, можуть використовуватися для пасування. Фрагменти тканини (експлантати) переносяться на нові чашки, мігруючі клітини можуть видалятися пересіванням, сумішшю версена і трипсину, а експлантати, що залишаються, утворюватимуть нові вирости.
Відомі такі первинні культури, як культура фібробластів курячого ембріона, культура клітин нирки теляти, лейкоцити.
3.2 Отримання моношарових культур клітин, що перевиваються
Як зазначалося вище, однією з методів отримання клітинних ліній, що перевиваються, є відбір клітин з підвищеною активністю росту і розмноження з популяції первинних культур. Відбір можна здійснити при регулярній зміні середовища, що омиває моношар первинно трипсинізованої клітинної культури. Для цього відбирають матраци з добре сформованим клітинним моношаром (самі матраци повинні мати рівне дно і не повинні мати на стінках подряпин та матових плям). Приготовлену для систематичної зміни ростове середовище розливають по невеликих судинах (щоб виключити бактеріальне забруднення) і зберігають при t - 4°.
Зміну середовища здійснюють регулярно, не рідше 1 разу на тиждень. Протягом перших 3 тижнів замінюють по 20-30% обсягу ростового середовища, протягом наступних 3-4 тижнів - 50-60%, пізніше проводять повну зміну середовища. Свіжу середу безпосередньо перед роботою підігрівають до t - 37 °.
У міру зміни середовищ клітини змінюють свою морфологію. Частина клітин округляється та відпадає від скла. Більшість клітин стягується до центру, і моношар набуває зірчастого вигляду. Самі клітини у своїй трохи подовжуються. Через 7-10 змін середовища в матрацах, як правило, починають з'являтися нові клітинні елементи, причому у різних культурах вони мають різну морфологію.
У культурі клітин нирки курячого ембріона у центрі моношару чи між стягнутими його ділянками з'являються округлені клітинні елементи, у тому числі поступово формуються скупчення як невеликих колоній. У культурі клітин нирки мавпи з'являються поодинокі утворення, що нагадують зерна. Клітини щільно прилягають одна до одної, утворюючи дрібні прозорі колонії. Кількість таких клітин зростає повільно, розміри колоній також майже не збільшуються. Колонії з'являються не тільки на дні матраца, але також на бічних поверхнях, на межі живильного середовища. Тому обов'язковою умовою при зміні живильного середовища є підтримка її постійного обсягу. У культурі клітин нирок ембріона людини на тлі масової дегенерації стягнутого в тяжі моношару виявляються великі полігональні клітини з довгими відростками.
Атипові клітинні елементи, що виникли в процесі відбору, повинні бути відокремлені від інших ділянок моношару і перенесені в окремі пробірки або матраци. Для цього може бути використаний метод версенізації або механічний відкол атипових клітин за допомогою бактеріологічної петлі або шпателя. Останній спосіб особливо необхідний під час роботи з культурою клітин нирок мавпи, де колонії атипових клітин щільно прикріплені до скла і від нього не відділяються.
При зміні живильного середовища у разі появи атипових клітин рекомендується обережно видалити більшу частину ростового середовища, а меншою частиною енергійно відполоскати моношар і це середовище розлити пробірками. В цьому випадку в середовищі можуть виявитися атипові клітини, що мають здатність утворювати колонії, придатні для подальших пересівань.
Після перенесення культури атипових клітин у новий посуд спостереження за основною культурою доцільно продовжити, оскільки процес виведення нової клітинної лінії дуже складний, і далеко не завжди відібрані атипові елементи дають початок життєздатній лінії клітин, що перевиваються. Необхідно, щоб вся робота з отримання нових клітинних ліній, що триває протягом багатьох місяців, проводилася з тими самими живильними середовищами, сироватками тварин і серіями антибіотиків.
Відомі такі первинні культури, як культура клітин нирки золотистого хом'ячка (BHK), культура клітин нирки сибірського гірського козерога (ПСГК), культура клітин нирки зеленої мавпи (CV).
3.3 Ролерне культивування клітин
Донедавна тканинні культури застосовувалися у вірусології переважно як одношарових стаціонарних культур. У багатьох випадках цей метод вирощування клітин є незамінним. Багаторічний досвід показує, що з одношарових стаціонарних культур зустрічається ряд труднощів, що з величезними витратами робочого дня і матеріалів. З цієї точки зору, вигідніші ролерні культури, які економічні, характеризуються оптимальним ставленням корисної площі культивування до обсягу живильного середовища та відкривають сприятливі можливості для накопичення клітинної маси.
Термін «ролерні культури» позначає метод культивування, при якому клітинний моношар розташовується по всій циліндричній поверхні судин, що горизонтально обертаються, і періодично омивається живильним середовищем. Через певні причини деяка кількість клітин може в окремих випадках бути зважена в культуральному середовищі. У подібному варіанті культуру клітин називають ролерно-суспензійною. "Врожайність" клітинної культури буде тим більшою, чим більша площа, з якої збирають клітини. Дослідники використовували різні шляхи збільшення площі поверхні, на якій відбувалося прикріплення та розмноження клітин. Для цього застосовували різного характеру основи з великою питомою поверхнею: тверду, губчасту, з вовни, колагену, на скляних спіралях і т.д. .Ратнером і В. А. Крикуном методику багатоярусного культивування. Клітини культивували в 1,5, 10 і 15-літрових суліях, повністю завантажених овальними скляними трубками, розташованими паралельно поздовжній осі судин. Корисна площа при цьому зростала в порівнянні зі стаціонарними одношаровими культурами в судинах того ж обсягу в 20 разів. Культивування проходило у 2 етапи. На першому етапі сулії обертали навколо горизонтальної осі з метою рівномірного розподілу клітин. Надалі, коли клітини прикріплювалися до скла, культивування тривало у стаціонарному положенні. Описана культуральна система успішно використана для культивування вірусу ящуру.
Найефективнішим виявилося обертання судин, у яких відбувалося розмноження клітин. Спочатку клітини вирощували в пробірках, але з розвитком технічного оснащення зросли обсяги культуральних судин, і від вирощування клітин в пробірках, що обертаються, дослідники перейшли до обертових пляшок. Ролерні культури почали застосовувати як накопичення клітин, так і розмноження вірусів.
Для ролерного культивування використовуються спеціальні стелажно-ярусні апарати для обертання сулій або барабани. Найчастіше для культивування використовують 0,5-3-літрові бутлі. У виробничих умовах обсяг їх може досягати 20 і більше літрів. Апарати для ролерного культивування прості, надійні та обслуговування їх нескладно. Велике значення має швидкість обертання суліїв. Вона не повинна бути надто великою, щоб не перешкоджати прикріпленню клітин, але й не надто низькою, оскільки тривале знаходження клітин у газовій фазі погіршує умови їх живлення. У роботах різних авторів швидкості обертання суліїв варіювали від 8-12 об/год, до 1 об/хв. Найбільш придатною для різних клітинних культур виявилася швидкість обертання флаконів у межах 0,5-1 об/хв. Рекомендується протягом перших 30 хв. після засіву клітин забезпечити високу швидкість обертання флаконів (0,5-1,0 об/хв) для рівномірного розподілу матеріалів, потім перевести їх на низьку швидкість обертання (20-30 об/год).
Посівна концентрація в 1 мл середовища становить для клітин СПЭВ, ВНК-21, HeLa, L - 60-80 тис., для диплоїдних клітин 100-200 тис., для первинних культур - 200-300 тис. Обсяг ростового середовища має становити 1/ 10, 1/20 частина об'єму ролерного флакона. Ролерний метод культивування дозволяє отримати більшу кількість клітин. Так, з флакона ємністю 3 л можна отримати врожай клітин HeLa у 8 разів, ВНК-21 - у 9 разів, АТ - у 11 разів більший, ніж з моношарової стаціонарної культурою флакона ємністю 1 л. Кратність економії середовищ під час використання 3-літрових флаконів становить клітин HeLa 2,8; ВНК-21 – 5,0, АТ – 4,0. Здібністю до зростання і розмноження в ролерних умовах мають субкультури, культури, що перевиваються, і рідше первинні, а також диплоїдні штами клітин. Для кращого розмноження клітин у ролерних апаратах потрібна адаптація їх до нових умов культивування. Ролерний метод культивування дозволяє отримати велику кількість клітин. Перевагою ролерних культур порівняно з традиційними стаціонарними культурами є, зокрема, більш економічне використання поживних середовищ та вищий вірусний антиген (на 1-2 lg).
3.4 Суспензійне культивування клітин
У 1953 році Оуенс із співробітниками вперше показав здатність клітин розмножуватися в рідкому середовищі у вільно суспендованому стані. З того часу метод суспензійного культивування привертає увагу дослідників у зв'язку з його високою ефективністю при накопиченні великих кількостей клітин. Виявилося, що клітини ліній, що перевиваються, на відміну від інших типів клітинних культур, можуть довго культивуватися у зваженому стані. Клітини в цих умовах розмножуються, не прикріплюючись до стінок культуральної судини, перебуваючи в суспензійному стані завдяки постійному перемішуванню середовища. При оптимальному режимі вирощування клітини в суспензіях швидко розмножуються, мають вищий «урожай», ніж у стаціонарних культурах. Первинні лінії клітин, що перевиваються, мають неоднакову здатність росту в суспензії. Так, гетероплоїдні та анеуплоїдні постійні лінії, на відміну від псевдодиплоїдних ліній, адаптуються швидше до зростання в суспензії.
Суспензійні культури готують із одношарових культур. Клітини відшаровують від скла за допомогою розчинів версена та трипсину. Осад клітин після центрифугування (1000 об/хв.) ресуспендують у свіжому поживному середовищі. Приготовлену суспензію поміщають культуральні судини (реактори, ферментери) і вирощують при постійному перемішуванні. У наукових дослідженнях концентрація клітин у вихідній суспензії коливається від 03 до 10х10 в 1 мл. Оптимальна концентрація клітин у вихідній суспензії має бути 2-5х10 за 1 мл. На думку Ерла та його співробітників, концентрація клітин у суспензованій культурі має бути такою, щоб фаза логарифмічного зростання наступала не пізніше 16-24 годин після приготування культури. Суспензійні клітинні культури проходять характерні стадії: лаг-фазу, фазу логарифмічного зростання, стаціонарну фазу та фазу логарифмічного відмирання. У першій стадії, як правило, кількість клітин зменшується, у другій стадії популяція клітин збільшується (логарифмічна стадія росту), у третій стадії збільшення кількості клітин не спостерігається (стаціонарна фаза). Якщо культивування продовжити далі, виявиться період зменшення чисельності клітин-фаза логарифмічного відмирання (фаза руйнування). Швидкість розмноження клітин у логарифмічній фазі зростання виражають часом генерації. Під часом генерації мають на увазі період, необхідний подвоєння популяції клітин у культурі. Для суспензійного вирощування клітин важливою умовою є перемішування рідини, яке має бути безперервним і достатньо інтенсивним, щоб підтримувати клітини у зваженому стані, перешкоджати їхньому осадженню та прикріпленню до стінок судини і водночас не викликати їхнього механічного пошкодження.
Перемішування суспензійних культур проводять лопатевими магнітними мішалками, а також круговими гойдалками. В даний час широко застосовують обертання флаконів і суліїв навколо поздовжньої осі (15-40 об/хв). На магнітних мішалках швидкість обертання становить 100-200 об/хв. Швидкість перемішування залежить від обсягу культури; малі обсяги культури вимагають невисокої швидкості, тоді як її необхідно збільшити за більших обсягів. Для запобігання осідання клітин на внутрішній поверхні судини виробляють силіконування. Силіконове покриття через свою гідрофобність перешкоджає прикріпленню клітин до стінки судини.
Внутрішні стінки культуральної судини змочують 5% або 10% розчином силікону і після випаровування розчинника (бензолового, ацетонового) судини витримують при 85°С і 200° (відповідно протягом 30 і 60 хв). Після охолодження судини наповнюють гарячою водою, що бідистилює, і залишають на 2 години, потім їх 3 рази обполіскують бідистильованою водою і висушують при 100°С. Судини стерилізують у сушильній шафі при 170°С протягом 2 годин.
Максимальне зростання клітин суспензії спостерігають при рН 7,0-7,2. Поживні середовища, що застосовуються для вирощування клітин у суспензії, не відрізняються від середовищ, що використовуються для вирощування клітинних ліній в одношаровій культурі. Найчастіше при культивуванні клітин у суспензіях беруть середовище Голка із дворазовою концентрацією амінокислот та вітамінів.
Суспензійні культури споживають у 2-7 разів більше глюкози, ніж моношарові. У процесі споживання глюкози клітини виділяють у середу токсичну їм молочну кислоту. Споживання клітинами глюкози та вироблення молочної кислоти йдуть паралельно і знаходяться у прямій залежності від щільності клітинної популяції. Корисним виявилося додавання до живильного середовища інсуліну в кількості від 40 до 200 ОД на 1 л. Додавання до живильного середовища інсуліну змінює співвідношення між кількістю поглиненої глюкози та виділеної молочної кислоти. Для клітин лінії L зазначений коефіцієнт може бути знижено з 74-81 до 37-38%.
Різні амінокислоти споживаються з живильного середовища клітинами, що ростуть, з неоднаковою швидкістю. Зазначено, що регулярне збільшення аргініну (20-40 мг/л) і збільшення кількості глутаміну до 450 мг/л сприяють зростанню зважених культур.
Додавання інозитолу (0,4 мг/л) дозволяє прискорити зростання культур амніотичних клітин людини. Бажаним є додавання до середовища каталази (1 мг/л) та тироксину (12 мг/л).
Великий інтерес становлять роботи, присвячені отриманню зважених культур клітин у синтетичному середовищі, що не містить сироватки крові. Робляться спроби збільшити в'язкість живильного середовища за рахунок безбілкових інгредієнтів. З цією метою використовується метил-целюлоза та гіалуронова кислота.
Метилцелюлоза в концентрації 0,1-0,2% має максимальну захисну дію на зважені в середовищі клітини. Протективна дія метилцелюлози полягає в тому, що молекули утворюють захисний шар навколо клітини, що запобігає пошкодженню клітин при перемішуванні середовища. Дуже важливим показником стану суспензійної культури є парціальний тиск кисню у рідкій фазі. Концентрація кисню в газовій фазі залежить від щільності клітинної популяції і нерідко буває нижчою за атмосферну. Нестача кисню веде до появи грануляції цитоплазми, клітини втрачають правильну округлу форму. При невеликому надлишку кисню клітини мають добре окреслену, правильну, округлу форму, і стають дуже великими при шкідливій дії надлишку кисню. Оптимальна концентрація кисню для різних клітинних культур знаходиться в межах від 9% до 17% або 293 мм рт. стовп. При концентрації кисню понад 20% відбувається інгібіція клітинного зростання. Так, при концентрації кисню 24% розмноження клітин бруньок ембріона кролика (лінія ERK) знижувалося наполовину, а при 30% зводилося до нуля. Підвищення концентрації кисню токсично впливає на клітинний метаболізм.
Таким чином, розмноження клітин у суспензії залежить від концентрації клітин у вихідній суспензії, аерації та рН середовища, складу живильного середовища, способу перемішування, обсягу суспензії та інших факторів.
Однорідність суспензії, можливість тривалої підтримки клітин у логарифмічній фазі зростання, перспективи математичного моделювання процесів клітинного зростання залежно від впливу факторів зовнішнього середовища, зручність багаторазового дослідження фізіологічного стану культури клітин у суспензії, висока економічність методу – ось далеко не повний перелік переваг суспензійних культур.
Суспензійні культури широко використовується у вірусологічних дослідженнях і для накопичення великих кількостей вірусомісткого матеріалу, при виготовленні вакцин та діагностичних препаратів.
3.5 Культивування клітин на мікроносіях
У 1967 р. Van Werel запропонував метод культивування, що поєднує елементи моношарового та суспензійного вирощування клітин, який він назвав методом «мікроносіїв». Суть його полягає в тому, що клітини прикріплюються і розмножуються на поверхні полімерних кульок-частинок «мікроносіїв» (МН), які містяться в суспензії за допомогою пристрою, що перемішує, наприклад мішалки. На одній частинці МН діаметром 160-230 мм може поміститися 350-630 (або в середньому 460) клітин. В одному мл середовища можна суспензувати кілька тисяч частинок мікроносія, при цьому загальна площа їх складе від кількох до 50 см 2 /мл.
Інокульовані у культиватор клітини прикріплюються до поверхні частинок МН і розмножуючись, утворюють суцільний моношар на кожній окремій частинці.
Основними перевагами цього є:
1) створення рівномірних умов по всьому обсягу судини, що уможливлює ефективно контролювати необхідні параметри (рН, р0 2 та ін); 2) отримання високої щільності клітинної популяції до 5-6 млн. клітин на 1 мл; 3) культивування одночасно кілька сотень мільярдів клітин; 4) запровадження постійного контролю над динамікою зростання клітин; 5) зниження зростання контамінації у зв'язку зі скороченням операцій, пов'язаних з розгерметизацією культуральної судини; 6) значна економія поживних середовищ; 7) можливість зберігати клітини, що виросли, безпосередньо на частинках при низьких температурах; 8) можливість штучно створювати різні концентрації МН з клітинами, що виросли на них; 9) можливість пасування культури без застосування трипсину шляхом додавання нових порцій мікроносія.
Мікроносії повинні мати:
Невеликий позитивний заряд у межах 1,5-1,8 МЕКВ/р. У зв'язку з тим, що більшість клітин тварин мають слабко негативний заряд, вони легше прикріплюватимуться до такого МН:
Щільність 1,05-1,15 г/см; зазначена щільність є оптимальною підтримки МН у зваженому стані;
Діаметр частинок від 100 до 250 мкм, що забезпечує площі для зростання кількох сотень клітин;
Гладку поверхню;
Прозорість;
Відсутність токсичності компонентів клітин;
Незначне вбирання компонентів середовища;
Універсальність, що забезпечує можливість використання їх для первинних, диплоїдних та гетероплоїдних клітин. Важливе значення мають властивості МН, які дозволяють їх багаторазово.
Проведено дослідження багатьох гранульованих препаратів різної хімічної природи, у тому числі з поперечно-зшитого (ПС) декстрану, ПС-агарози, ПС-полівінілпіролідону, поліакрилнітриту, пористого селікагелю, полістиролу, капрону, нейлону, алюмосилікату з метою.
Придатними є лише деякі з них, що головним чином мають у своїй основі ПС-декстран.
Декілька зарубіжних фірм розробили комерційні препарати мікроносіїв, готові до вживання: Цитодекс-1, 2, 3 (Франція, Швеція), Супербіт (США, Англія), Біосілон (Данія). Вартість перерахованих препаратів досить висока, тому необхідно проводити дослідження з розробки та виробництва вітчизняних МН.
Культивування клітин на мікроносіях проводять у звичайних ферментерах для суспензійного культивування. У ферментері не повинно бути будь-яких виступів, кишень, щоб запобігти накопиченню мікроносіїв у застійних зонах. Тому розумно використовувати ферментери з круглим дном та гладкими стінками. Внутрішня поверхня ферментера повинна бути силіконізована для запобігання прилипанню мікроносіїв до скла або нержавіючої сталі ферментера.
Для контролю за навколишніми культурами такими умовами, як рН і О 2 , може бути використане стандартне обладнання. Швидкість перемішування суспензії з носієм має бути 40-60 об/хв. Для вирощування МН застосовуються різні типи клітин.
Концентрація цитодексу може змінюватись від 0,5 до 5 мг/мл. Однак, при виробництві профілактичних вакцин, зазвичай застосовують кінцеву концентрацію цитодексу, що не перевищує 1 мг/мл. Підвищення концентрації до 3 мг/мл і вище створює додаткові труднощі, пов'язані з необхідністю перфузії живильного середовища та її часткової заміни, що ускладнює технологічний процес.
Посівна концентрація клітин, а також умови культивування на МН у перші години значною мірою визначають оптимальні параметри для проліферації та максимального накопичення клітин. Показано, що посів 10 клітин/мл лінії нирок мавп (Vero), що перевивається, і диплоїдних клітин фібробластів ембріона людини (MRC-5) у зменшеному до 1/3 об'єму живильного середовища і при періодичному включенні мішалки (30 об/хв) на одну хвилину через кожну годину протягом 4 годин, з подальшим додаванням живильного середовища до кінцевого обсягу, веде до збільшення проліферації клітин та їх кількості порівняно з контролем (повний обсяг живильного середовища в момент посадки клітин та безперервна робота мішалки з початку культивування).
Важливе значення для культивування клітин МН має живильне середовище. Правильний підбір живильного середовища також сприятиме оптимізації процесу проліферації клітин та їх якість. Необхідно проводити добір поживних середовищ для культивування клітин різних типах МН. Показано, що лінія клітин нирок мавп (Vero), що перевивається, на цитодексі дає найбільший вихід при використанні середовища Голка ДМЕ (посадкова концентрація клітин 10 5 мл) але порівняно з середовищем ВМЕ і 199. Якщо ж кількість клітин при посадці знизити до 10 4 , то кращі результати дає середа 199. Усі випробувані середовища містили 10% фетальної сироватки.
3.6 Вирощування вірусів у культурах клітин
В даний час для виділення і розмноження вірусів тварин використовуються первинні культури, штами клітин і клітинні лінії, що встановилися. Загалом процедура виявляється однаковою для всіх вірусів.
Середовище видаляють з клітинного моношару і моношар промивають збалансованими сольовими буферними розчинами (СБСР) або фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) для видалення інгібіторів (антитіл), які можуть бути присутніми в середовищі. Вірусні частинки суспендуються у невеликій кількості СБСР або ФСБ та адсорбуються клітинами протягом 30-60 хв. Після цього сольові розчини замінюються свіжим середовищем.
Зараження вірусами клітин, що культивуються, викликає характерні морфологічні зміни клітин. Кінцеві дегенеративні клітинні процеси (цитопатогенний ефект, ЦПЭ) виявляються лише кілька тижнів зростання у присутності вірусів, але у деяких випадках ЦПЭ виявляються вже 12 год. Деталі морфологічних змін виявляються різними у разі різних вірусів.
Якщо замість продуктивної інфекції вірус викликає клітинну трансформацію, це також супроводжується характерними змінами морфології та особливостей зростання клітин.
4. Обережності при роботі із зараженими вірусами клітинами
Віруси мають цитопатогенну дію і служать етіологічними агентами при багатьох захворюваннях людини та тварин. Крім того, багато вірусів (наприклад, онкорнавіруси, вірус герпесу тип II, аденовіруси, вірус поліоми та SV40) є, мабуть, агентами, що викликають розвиток пухлин у тварин. Через здатність вірусів проходити через бактеріальні фільтри буває важко виключити віруси з культур незаражених клітин за наявності вірусних суспензій, коли можлива передача вірусу через повітря культуральної кімнати.
Наведені нижче запобіжні заходи мають найзагальніший характер і застосовні тільки в тих випадках, коли віруси не становлять якоїсь особливої небезпеки. При використанні особливо небезпечних вірусів, які становлять небезпеку для здоров'я співробітників лабораторії або людей і тварин навколишнього світу, слід застосовувати додаткові запобіжні заходи. До вірусів, що становлять особливу небезпеку, відносяться віруси ньюкаслської хвороби, віруси ящуру, віруси везикулярного стоматиту, віруси віспи, віруси сказу, віруси герпесу типу і так далі. Крім того, не можна бути впевненим, що навіть такі віруси, як SV40, не становлять небезпеки для людини.
Для зараження клітин та зростання заражених вірусами клітин має використовуватися спеціальна кімната чи група кімнат.
Ніякі живі віруси не повинні виноситися з цих приміщень, не будучи укладені в контейнери, що щільно закриваються. Слід вживати запобіжних заходів, щоб зовнішні поверхні цих контейнерів не були забруднені вірусними частинками.
При роботі з вірусами повинні бути використані спеціальні захисні одяги (лабораторні халати). Після роботи цей одяг повинен поміщатися у спеціальний бак для автоклавування.
Усі середовища та скляний посуд, які були в контакті з вірусами, повинні бути оброблені хлоросом; тільки після цього їх можна виносити із приміщення, призначеного для роботи з вірусами.
Весь пластиковий посуд має бути поміщений у спеціальний бак для автоклавування.
Обладнання для зберігання та обробки вірусного матеріалу повинно розміщуватись усередині приміщення для роботи з вірусами.
Лабораторія має бути оснащена двоцикловими автоклавами, щоб співробітники лабораторії були захищені від шкідливих матеріалів.
4.1 Виявлення вірусів
Виявити присутність вірусів та визначити їх кількість можна за допомогою цілого ряду різних тестів, наприклад:
1) Активність вірусу вимірюється шляхом визначення кількості матеріалу, що містить вірус, необхідного для того, щоб викликати специфічну реакцію в організмі господаря. Реакція, що індукується вірусом, може відбуватися за типом «все або нічого» (тобто наявність або відсутність інфекції), а може бути виражена кількісно, наприклад тривалістю часу, необхідного для прояву інфекції, або числом уражень у шарі чутливих клітин. Кількісне визначення вірусної активності називається титруванням.
Найменша кількість вірусу, здатне викликати відповідну реакцію, називається інфекційною одиницею, і титр вихідної вірусної суспензії виражається числом інфекційних одиниць, що припадають на одиницю об'єму. Наприклад, якщо мінімальна кількість суспензії вірусу грипу, що викликає у миші пневмонію при інтраназальному введенні суспензії тканини інфікованої легені у розведенні 1:10 6 дорівнює 0,1 мл, то це означає, що титр вірусу грипу у вихідній суспензії0 тканини одиниць на 1мл-1/(10~1-10-6) =10 7 .
Як правило, обов'язковим компонентом методу титрування вірусу є тест, що дозволяє оцінити результат інокуляції як позитивний чи негативний. Наприклад, при титруванні вірусів тварин таким тестом може бути наявність або відсутність видимих уражень у культурі клітин, запальна реакція на місці інокуляції вірусу в шкіру або рогівку, паралічі, що виникають у тварини внаслідок введення вірусу в мозок, тощо. Іноді розмноження вірусу можна виявити і відсутність видимої реакції з боку організму-господаря: наприклад, зараження курячих ембріонів міксовірусами можна виявити за появою гемагглютинінів в аллантоісной рідини.
Найкращі результати дають методи титрування, в основі яких лежить підрахунок числа дискретних уражень на певній площі шару клітин, заражених відомою кількістю матеріалу, що містить вірус. У випадках коли число чутливих до вірусу і доступних для нього клітин можна практично вважати нескінченно великим, як, наприклад, при зараженні фагом одношарової культури бактерій на живильному агарі або при зараженні вірусом суцільної одношарової культури тварин клітин, ураження, що викликаються вірусом, або бляшки, що утворюються фагом, у цьому сенсі подібні до колоній бактерій на щільному поживному середовищі. Як число цих колоній пропорційно числу бактеріальних клітин, що містяться в препараті, що титрується, так і число бляшок прямо пропорційно кількості вірусу, доданому до одношарової культури утворення зараженими клітинами вірусних частинок, які можуть бути ідентифіковані, наприклад, за природою нуклеїнових кислот і симетрії частинок.
2) Утворення зараженими клітинами нуклеїнових кислот, які можуть мати характерну щільність при центрифугуванні в градієнті щільності або характерним розміром при електрофорезі в агарозному гелі або центрифугуванні в градієнті концентрації сахарози.
3) Утворення зараженими клітинами або трансформованими клітинами характерних антигенів, які можуть бути візуалізовані за допомогою фарбування флуоресціюючими специфічними антитілами або викликати зміни в клітинній мембрані, що призводять до адсорбції гему. У прямому методі антитіла, отримані до вірусних антигенів, поєднуються з флуорохромом та використовуються для фарбування заражених клітин. Позитивна реакція (жовто-зелений колір у люмінесцентному мікроскопі) вказує на присутність у клітинах вірусних антигенів. Цей метод, отже, може бути використаний виявлення клітинної трансформації, коли антитіла виробляються, наприклад, проти ранніх антигенів вірусу SV40, або виявлення освіти зрілих вірусів, коли виходять антитіла проти капсидних білків. У непрямому методі антитіла не поєднуються із флуорохромом. Натомість після взаємодії антитіл з антигенами у фіксованих препаратах клітин до них додаються антигамма-глобулінові антитіла, кон'юговані з флуорохромом. Цей метод чутливіший і дозволяє уникнути кон'югації кожного індивідуального антитіла з флуоресцентним барвником. Так, одні і ті ж флуоресцентні антитіла до антитіл кролика (отримані у овець проти кролячих гамма-глобулінів) можуть бути використані для фарбування будь-яких антитіл, що утворюються у кроликів і взаємодіють з вірусними антигенами в продуктивно заражених або трансформованих клітинах. Ще більш непрямий, але значно чутливіший метод, що не вимагає використання флуоресцентного мікроскопа – пероксидазний – антипероксидазний метод. Відповідно до цього методу, кролячі антитіла взаємодіють з антигенами фіксованих клітин і потім покриваються антитілами кози до імуноглобулінів кролика, кон'югованими з комплексами пероксидази хрону та кролячої антипероксидази. Після цього препарати обробляють діаміно-бензидином та перекисом водню; коричневе забарвлення вказує на наявність антигенів.
4) Наявність антигенів на вірусних частинках може призводити до реакцій гемаглютинації, що дозволяє проводити кількісну оцінку. У багатьох вірусів є антигени, які можуть адсорбуватися на еритроцитах та викликати їх злипання. При взаємодії великої кількості вірусних частинок та еритроцитів утворюється мережа клітин і суспензія аглютинує, тобто. еритроцити випадають у осад. Існує деяка специфічність, яка полягає в тому, що певні віруси викликають аглютинацію еритроцитів певних тварин, але якщо виявлено активну комбінацію, то гемагглютинація стає швидким тестом, що дозволяє визначити титр вірусу. Кров відбирають гепаринізований шприц і еритроцити промивають триразовим переосадженням в 0,85%-ном NaCl при 200 g протягом 10 хв. Остаточний осад еритроцитів суспендують у 200-кратному обсязі 0,85%-ного розчину NaCl. Найзручніше проводити тест на гемаглютинацію в мікротитрувальних пластинках. У серію лунок мікротитрувальної пластинки вносять по 25 мкл 0,85% NaCl або ФСБ; в першу лунку вносять 25 мкл суспензії вірусу, суміш перемішують (розведення 1:2). 25 мкл потім переносять з першої лунки в другу (розведення 1:4) і так далі, до кінцевого розведення 1:2048. Після цього кожну лунку додають по 25 мкл суспензії еритроцитів, суміш перемішують і залишають при 4°С, кімнатній температурі або 37 °С до настання гемаглютинації (1-2 год). У лунках, де відбулася аглютинація, осад еритроцитів має неправильну форму, а лунках, де гемагглютинації був, клітинний осад утворює компактну точку дні лунки. Розведення в останній лунці, в якій відбувалася гемаглютинація, розглядається як титр, і цьому розведенню приписується значення 1 гемаглютинуючої одиниці (ГАЕ). Попереднє розведення містить відповідно 2 ДАЄ і таке інше.
5) Освіта зараженими клітинами характерних ферментів, або ферментів, які легко відрізняються за властивостями від відповідних ферментів клітин-господарів.
4.2 Культивування пікорнавірусів на прикладі отримання поліовіруса типу 3 у культурі клітин HeLa
В якості конкретної методики культивування вірусів можна навести спосіб вирощування поліовіруса в клітинах, що перевиваються.
Усі процедури проводять у стерильних умовах.
Певні сублінії клітин HeLa (наприклад, HeLa S3) можуть зростати у середовищах з низькою концентрацією іонів кальцію (наприклад, CaS2MEM). Для ефективного зараження суттєво, щоб клітини добре росли як однорідної суспензії. Клітини осаджують низькошвидкісним центрифугуванням (15 хв при 900 g) і ресуспендують серед CaS2MEM до концентрації ~ 2 . 10 7 кл/мл (~1/20 вихідного обсягу).
До клітинної суспензії додають вірус у концентрації 10-50 БОЕ на клітину; інкубують її на магнітній мішалці протягом 1 години при 35 °С.
Суспензію розводять тим самим середовищем до концентрації 2 . 10 6 кл/мл і додають 100 мкКі [3 Н]-уридину.
Клітинну суспензію інкубують протягом 8 годин, після чого клітини осаджують низькошвидкісним центрифугуванням (15 хв при 900 g) і промивають один раз фосфатним буферним розчином (PBS), що не містить іонів магнію і кальцію.
Клітини ресуспендують PBS (5-10 7 кл/мл) і проводять три цикли заморожування - відтавання.
Залишки клітин видаляють центрифугуванням.
Супернатант зберігають для подальшого очищення.
Список літератури
1. Адамс Р. Методи культури клітин для біохіміків. - М: Світ, 1983, 263 с.
2. Вірусологія. Методи. / За ред. Б. Мейхі. - М: Світ, 1988, 344 с.
3. Голубєв Д.Б., Сомініна А.А., Медведєва М.М. Посібник із застосування клітинних культур у вірусології. - Л.: Медицина, 1976, 224 с.
4. Дияконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А., Денисенко Г.Ф., Калмикова Т.П. Культивування клітин та тканин тварин. – Ставрополь: Ставроп. Щоправда, 1988, 2 частина, 91 с.
5. Тваринна клітина у культурі під. ред. Л.П. Дьяконова, В.І. Ситькова. - М: 2000.
6. Культура тваринних клітин. Методи. / За ред. Р. Фрешні. - М: Мир, 1989, 333 с.
7. Посібник з ветеринарної вірусології. / За ред. В.М. Сюріна. - М: Колос, 1965, 687 с.
8. Сергєєв В.А. Репродукція та вирощування вірусів тварин. - М: Колос, 1976, 303 с.
9. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Мімс С., Сембрук Дж., Уайт Д. Біологія вірусів тварин. - М: Світ, 1977, т. 1, 447 с.
Розміщено на Allbest.ru
...Подібні документи
Основні методи зараження курячих ембріонів вірусом. Етапи одержання субкультур: зняття клітинного шару, відділення та посів клітин, методика зараження клітинних культур вірусом, облік результатів. Напівперевиваються культури клітин людини і тварин.
презентація , доданий 29.01.2015
Поживні середовища в мікробіології, їх класифікація та різновиди, сфери та особливості використання. Культивування аеробних та анаеробних мікроорганізмів. Методи кількісного обліку мікроорганізмів, основні правила та умови зберігання їх культур.
реферат, доданий 25.03.2013
Фловани у вищих рослинах: структура, головні представники, локалізація, функціональна роль. Морфофізіологічні та біохімічні характеристики клітинних та калусних культур чайних рослин. Визначення вмісту флаванів та проантоціанідинів.
дипломна робота , доданий 02.02.2018
Види носіїв для іммобілізації клітин та ферментів. Іммобілізовані культури та можливість їх застосування у різних галузях. Типи реакторів із використанням іммобілізованих культур. Переваги та недоліки використання іммобілізованих культур.
курсова робота , доданий 15.01.2012
Вивчення процесу створення штучних клітинних асоціацій за допомогою яких можна здійснити життєдіяльність азотфіксуючих організмів у клітинах та тканинах культурних рослин. Асоціації ендо- та екзосімбіотичного типу. Цілі створення популяцій.
презентація , доданий 18.03.2015
Значення вологості середовища при вирощуванні ферментів на сипучих середовищах. Вплив ступеня аерування культур мікроскопічних грибів. Вплив складу середовища та тривалості культивування на біосинтез ліпази. Способи обробки та вирощування культури.
презентація , додано 19.03.2015
презентація , доданий 23.02.2014
Методи виділення чистих культур мікроводоростей та способи їх ідентифікації. Виділення чистої культури Euglena glacilis; розгляд способів визначення життєздатності клітин Вивчити вплив роз'єднувачів дихання та синтезу АТФ на рухливість клітин.
дипломна робота , доданий 24.05.2012
Специфічні фактори противірусного імунітету та синтез антитіл до певного антигену. Клітини пам'яті та видача імунної відповіді у формі біосинтезу антитіл. Поширення інфекційного бронхіту птахів та ящера. Культивування вірусів у клітинах.
контрольна робота , доданий 17.11.2010
Застосування клітинних технологій у селекції рослин. Використання методів in vitro у віддаленій гібридизації. Роботи з культивування калюсу з метою отримання нового селекційного матеріалу. Гібридизація соматичних клітин та її основні результати.
1966 р.).
Методи культивування клітин отримали значний розвиток у 1940-х 1950-х роках у зв'язку з дослідженнями у галузі вірусології. Вирощування вірусів у культурах клітин дало можливість отримання чистого вірусного матеріалу для вакцин. Вакцина проти поліомієліту стала одним із перших препаратів, масово вироблених з використанням технології культивування клітин. У 1954 р. Ендерс, Уеллер і Роббінс отримали Нобелівську премію "За відкриття здатності вірусу поліомієліту рости в культурах різних тканин". У 1952 р. була отримана широко відома лінія ракових клітин людини HeLa.
Основні засади культивування[ | ]
Виділення клітин[ | ]
Для культивування поза організмом живі клітини можна отримати кількома способами. Клітини можуть бути виділені з крові, але зростання в культурі здатні тільки лейкоцити. Моноядерні клітини можуть бути виділені з м'яких тканин за допомогою таких ферментів, як колагеназа, трипсин, проназа, що руйнують позаклітинний матрикс. Крім того, в живильне середовище можна помістити шматочки тканин та матеріалів.
Культури клітин, взятих безпосередньо від об'єкта (ex vivo), називаються первинними. Більшість первинних клітин, крім пухлинних, мають обмежений термін використання. Після певної кількості поділок такі клітини старіють і припиняють ділитися, хоча можуть при цьому зберегти життєздатність.
Існують иммортализованные («безсмертні») лінії клітин, здатні розмножуватися нескінченно. У більшості пухлинних клітин ця здатність є результатом випадкової мутації, але в деяких лабораторних клітинних ліній вона придбана штучно шляхом активації гена теломерази.
Культивування клітин[ | ]
Клітини вирощують у спеціальних живильних середовищах, при постійній температурі. Для культур рослинних клітин використовується регульоване освітлення, а клітин ссавців зазвичай необхідна також спеціальна газове середовище, підтримувана в інкубаторі клітинних культур . Як правило, регулюється концентрація в повітрі вуглекислого газу та пари води, але іноді також і кисню. Поживні середовища для різних культур клітин розрізняються за складом, концентрації глюкози, складом факторів росту та ін. Фактори росту, що використовуються в живильних середовищах для клітин ссавців, найчастіше додають разом із сироваткою крові. Одним із факторів ризику при цьому є можливість зараження культури клітин пріонами чи вірусами. При культивуванні однією з важливих завдань є виключення або мінімізація використання заражених інгредієнтів. Однак на практиці це буває досягнуто не завжди. Найкращим, але й найдорожчим способом є додавання замість сироватки очищених факторів зростання.
Перехресне забруднення клітинних ліній[ | ]
Працюючи з клітинними культурами вчені можуть зіштовхнутися з проблемою перехресного забруднення.
Особливості вирощування клітин[ | ]
При вирощуванні клітин, через постійне поділу може виникнути їх надлишок у культурі, і, як наслідок, виникають такі проблеми:
Для підтримки нормального функціонування культур клітин а також для запобігання негативним явищам періодично проводять заміну живильного середовища, ування та трансфекція клітин. Щоб уникнути забруднення культур бактеріями, дріжджами або іншими лініями клітин, всі маніпуляції зазвичай проводять з дотриманням правил асептики в стерильному боксі. Для придушення мікрофлори в живильне середовище можуть бути додані антибіотики (пеніцилін, стрептоміцин) та протигрибкові препарати (амфотерицин B).
Культивування людських клітин дещо суперечить правилам біоетики, оскільки клітини, що ізольовано вирощуються, можуть пережити батьківський організм, а потім використовуватися для проведення експериментів або для розробки нових методів лікування та вилучення з цього прибутку. Перше судове рішення у цій галузі було винесено у Верховному суді штату Каліфорнія у справі «Джон Мур проти представників Каліфорнійського університету», згідно з яким пацієнти не мають жодних прав власності на лінії клітин, отриманих із органів, видалених за їх згодою.
Гібридому [ | ]
Використання клітинних культур[ | ]
Масове культивування клітин є основою для промислового виробництва вірусних вакцин та різноманітних продуктів біотехнології.
Продукти біотехнології[ | ]
Промисловим методом з культур клітин отримують такі продукти, як ферменти, синтетичні гормони, моноклональні антитіла, інтерлейкіни, лімфокіни, протипухлинні препарати. Хоча багато простих білків відносно просто можуть бути отримані з використанням у бактеріальних культурах, більш складні білки, такі як глікопротеїни, в даний час можуть бути отримані тільки з тварин клітин. Одним з таких найважливіших білків є гормон еритропоетин. Вартість вирощування культур клітин ссавців є досить високою, тому в даний час проводяться дослідження щодо можливості виробництва складних білків у культурах клітин комах або вищих рослин.
Тканинні культури[ | ]
Культивування клітин є невід'ємною частиною технології культивування тканин та тканинної інженерії, оскільки саме воно визначає основи вирощування клітин та підтримки їх у життєздатному стані ex vivo.
Вакцини [ | ]
Із застосуванням методики культивування клітин у цей час випускаються вакцини проти поліомієліту, кору, епідемічного паротиту, краснухи, вітрянки. Внаслідок загрози пандемії грипу, що викликається штамом вірусу H5N1, зараз уряд Сполучених Штатів фінансує дослідження щодо отримання вакцини проти пташиного грипу з використанням клітинних культур.
Культури клітин не ссавців[ | ]
Культури клітин рослин[ | ]
Культури клітин рослин, як правило, вирощуються або у вигляді суспензії в рідкому поживному середовищі, або у вигляді калюсної культури на твердій поживній основі. Культивування недиференційованих клітин та калюсу вимагає дотримання певного балансу гормонів росту рослин ауксинів та цитокінінів.
Бактеріальні, дріжджові культури[ | ]
Основна стаття:
Для культивування невеликої кількості клітин бактерій та дріжджів клітини висіють на тверде живильне середовище на основі желатину або агар-агару. Для масового виробництва застосовують вирощування в рідких живильних середовищах (бульйонах).
Вірусні культури[ | ]
I. Культури клітин
Найбільшого поширення мають одношарові культури клітин, які можна розділити на 1) первинні (первинно трипсинізовані), 2) напівперевиваються (диплоїдні) і 3) перевиваються.
За походженнямвони класифікуються на ембріонштні, пухлинні та з дорослих організмів; з морфогенезу- на фібробластні, епітеліальні та ін.
Первиннікультури клітин - це клітини будь-якої тканини людини або тварини, які мають здатність рости у вигляді моношару на пластмасовій або скляній поверхні, покритій спеціальним живильним середовищем. Термін життя таких культур обмежений. У кожному конкретному випадку їх одержують із тканини після механічного подрібнення, обробки протеолітичними ферментами та стандартизації кількості клітин. Первинні культури, отримані з нирок мавп, нирок ембріона людини, амніону людини, курячих ембріонів, широко використовуються для виділення та накопичення вірусів, а також для виробництва вірусних вакцин.
Напівперевиваються(або диплоїдні ) культури клітин - клітини одного типу, здатні in vitro витримувати до 50-100 пасажів, зберігаючи у своїй свій вихідний диплоїдний набір хромосом. Диплоїдні штами фібробластів ембріона людини використовуються як для діагностики вірусних інфекцій, так і для виробництва вірусних вакцин.
Перевиваютьсяклітинні лінії характеризуються потенційним безсмертям та гетероплоїдним каріотипом.
Джерелом ліній, що перевиваються бувають первинні клітинні культури (наприклад, СОЦ, ПЕМ, ВНК-21 - з нирок одноденних сирійських хом'яків; ПМС - з нирки морської свинки та ін) окремі клітини яких виявляють тенденцію до нескінченного розмноження in vitro. Сукупність змін, що призводять до появи з клітин таких особливостей, називають трансформацією, а клітини тканинних культур, що перевиваються, - трансформованими.
Іншим джерелом клітинних ліній, що перевиваються, є злоякісні новоутворення. І тут трансформація клітин відбувається in vivo. Найбільш часто у вірусологічній практиці застосовуються такі лінії клітин, що перевиваються: HeLa - отримана з карциноми шийки матки; Нер-2 – з карциноми гортані; Детройт-6 – з метастазу раку легені у кістковий мозок; RH – з нирки людини.
Для культивування клітин необхідні живильні середовища, які за своїм призначенням поділяються на ростові та підтримуючі. У складі ростових поживних середовищ має бути більше поживних речовин, щоб забезпечити активне розмноження клітин для формування моношару. Підтримуючі середовища повинні забезпечувати лише переживання клітин у сформованому моношарі при розмноженні в клітині вірусів.
Широке застосування знаходять стандартні синтетичні середовища, наприклад, синтетичне середовище 199 та середовище Голка. Незалежно від призначення всі поживні середовища для культур клітин конструюються на базі збалансованого сольового розчину. Найчастіше ним є розчин Хенкса. Невід'ємний компонент більшості ростових середовищ - сироватка крові тварин (теляча, бичача, кінська), без наявності 5-10% якої розмноження клітин та формування моношару не відбувається. До складу підтримуючих середовищ сироватка не входить.
I. Культури клітин - поняття та види. Класифікація та особливості категорії "I. Культури клітин" 2017, 2018.
ІІ. Бездротові засоби зв'язку I. Дротові засоби зв'язку Ø Міський телефонний зв'язок Ø Прямий телефонний зв'язок (селекторний)Ø Радіотелефонний зв'язок («Алтай») Ø Індуктивний зв'язок (ЕКВ зв'язок «Дістон», «Нальмес») Ø... .
Таблиця 15 Таблиця 14 Таблиця 13 Таблиця 12 Таблиця 11 Дороги Руху по складним відсоткам у різні роки експлуатації Величини коефіцієнтів m, K0, K0m при зростанні інтенсивності Таблиця... .
Заняття №5 Гальмівна система Тема №8 Механізми керування Улаштування автомобільної техніки Проведення групового заняття План – конспект Викладач циклу ПОПОН підполковник Федотов С.А. "____"... .
Рис.5.9. Про підрізання зубів коліс. Розглянемо, як пов'язаний коефіцієнт зсуву рейки з числом зубів, яке може бути нарізане рейкою на колесі. Нехай рейка встановлена в положенні 1 (рис.5.9). У цьому випадку пряма головка рейки перетне лінію зачеплення N-N у т. і... .
Los verbos irregulares Іти - ir Є - comer Спати - dormir Хотіти - querer Я Йду Їм Сплю Хочу Ти Йдеш їж Спиш Хочеш Він, вона Іде Їсти Спить Хоче Ми Ідемо Їмо Спимо Хочемо Ви йдете їсте Спите Хочете Вони йдуть...