Основи молекулярної терапії. Лікарські засоби на основі олігонуклеотидів

Ліки для генів

Давня мрія медиків - мати у своєму розпорядженні речовини, які б на конкретні гени, тобто. на причину багатьох хвороб. Адже на основі таких речовин можна створювати лікарські препарати – справжні «чарівні кулі», здатні вражати спадковий матеріал різних інфекційних агентів, не завдаючи шкоди організму людини, а також пригнічувати активність онкогенів, відповідальних за злоякісне зростання клітин. Створення подібних речовин, спрямованих на генетичний матеріал, - одне з головних завдань молекулярної біології, оскільки з їх допомогою можна досліджувати функції генів і, в кінцевому рахунку, керувати роботою останніх

Але як можна змінити потрібну генетичну програму? Адже всі гени мають подібні хімічний склад і структуру: відмінності між ними зводяться лише до порядку чергування чотирьох мономерних блоків - нуклеотидів A, T, G, C. Для того, щоб впливати на певний ген, молекула речовини має якимось чином розпізнати цю нуклеотидну послідовність - Завдання, на перший погляд, нерозв'язне.

Але група сибірських хіміків, які приїхали до Новосибірського академмістечка в перші роки його створення, вважала інакше. Співробітники Інституту органічної хімії СО АН СРСР (Новосибірськ) Н. І. Гриньова та Д. Г. Кнорре на основі принципу молекулярного впізнавання, що використовується самою природою, сформулювали ідею спрямованого впливу на гени за допомогою олігонуклеотидів - фрагментів нуклеїнових кислот, «озброєних» групами. Першу роботу з олігонуклеотидів сибірські хіміки опублікували в 1967 р. - саме ця дата і вважається сьогодні офіційною датою виникнення нового напряму в молекулярній біології та фармакології.

Вони були першими

Здійснення цього незвичайного за сміливістю проекту (тоді ніде у світі навіть не планувалося проведення подібних досліджень) на початковій стадії велося невеликою групою молодих співробітників, аспірантів та студентів НГУ. Починати довелося практично з нуля, оскільки тоді ще не вміли синтезувати олігонуклеотиди у помітних кількостях; не існувало технічних приладів, необхідні роботи з малими кількостями нуклеїнових кислот та ефективної методики визначення їх послідовності. Вирішити ці проблеми нашим хімікам вдалося завдяки міждисциплінарності - одному з принципів, які лягли в основу діяльності Сибірського відділення.

У НДВГ було організовано виробництво нуклеїнових кислот, розроблено методи їхньої хімічної модифікації; Разом з співробітниками Інституту ядерної фізики вдалося створити прилади для аналізу нуклеїнових кислот та маніпуляції з їх малими кількостями, а разом з хіміками МДУ - розгорнути роботи зі створення автоматичних синтезаторів олігонуклеотидів. В результаті в розпорядженні вчених виявилися практично всі необхідні аналітичні методи та прилади – біологічні дослідження можна було розпочинати.

Експерименти, проведені спочатку на простих моделях, а потім на природних нуклеїнових кислотах, показали, що олігонуклеотиди справді взаємодіють із нуклеїновими кислотами - мішенями з високим ступенем вибірковості. У тому випадку, коли до олігонуклеотидів приєднані реакційно-здатні групи, відбувається спрямована хімічна модифікація мішеней – нуклеїнових кислот. До того ж, вперше було продемонстровано, що за допомогою цих реагентів можна придушити вірусні інфекції у тварин, а також доведено можливість введення їх в організм через шкіру та слизові оболонки тощо.

Ранні публікації, присвячені біологічним ефектам олігонуклеотидів, викликали величезний інтерес фахівців у всьому світі. У 1988 р. в Академмістечку було проведено перший у світі симпозіум щодо ген-спрямованих речовин на основі фрагментів нуклеїнових кислот. До роботи зі створення подібних препаратів включилися вчені США, Франції, та був інших країн; виникли десятки компаній, що поставили собі за мету створити терапевтичні препарати на основі олігонуклеотидів.

Комплементарні ліки

Першими із препаратів ген-спрямованої дії стали так звані антисмислові олігонуклеотиди, призначені для вибіркової інактивації вірусних РНК та деяких клітинних РНК. Спочатку передбачалося, що до цих олігонуклеотидів будуть приєднані реакційно-здатні групи, які мають хімічно модифікувати чи руйнувати цільові нуклеїнові кислоти. Проте з'ясувалося, що приєднання олігонуклеотидів до РНК-мішені саме собою на неї настільки великий вплив, що може провокувати її руйнування клітинними ферментами.

Д. Г КНОРРЕ - академік РАН, спеціаліст у галузі хімічної кінетики, молекулярної біології та біоорганічної хімії. Завідувач лабораторії хімії природних полімерів (1960-1984 рр.), відділом біохімії та лабораторією хімії нуклеїнових кислот (1970-1984 рр.) Інституту органічної хімії СО АН СРСР, директор Інституту біоорганічної хімії 99 8 )

Антисмислові підходи, засновані на використанні нуклеотидів та нуклеїнових кислот для придушення біологічної активності нуклеїнових кислот, обіцяють цікаві перспективи у тих випадках, коли потрібно задавити реалізацію небажаної інформації в живих організмах. Насамперед відкривається перспектива створення нового покоління противірусних та протипухлинних препаратів. Такі препарати мають одну незаперечну перевагу перед іншими… Усі олігонуклеотиди незалежно від мішені, на яку вони націлені, можуть бути створені за єдиною технологією. Варіювати потрібно лише послідовність нуклеотидів. Зокрема, вірусології та онкології часто доводиться стикатися з таким явищем, як виникнення стійкості до препаратів. Це відбувається найчастіше тому, що у окремої вірусної частки або окремої ракової клітини відбувається мутація, що веде до такої стійкості. У будь-якому іншому випадку потрібно розпочинати емпіричний пошук нового лікарського препарату. У разі антисмислових впливів потрібно лише визначити, яка зміна у структурі вірусного геному чи онкогену призвела до появи стійкості. Після чого відразу стає зрозумілим, як за тією самою єдиною технологією створювати новий препарат*.

* Соросівський освітній журнал. – 1998. – 12. – C. 25-31.

Найпотужнішим засобом «вимкнення» генів виявилися інтерферуючі РНК – короткі дволанцюгові комплекси з РНК-олігонуклеотидів. Коли такий комплекс вводять у клітину, один із ланцюжків зв'язується з комплементарною їй послідовністю в інформаційній РНК клітини. Це є сигналом до початку роботи групи ферментів, які розрізають РНК, пов'язану з олігонуклеотидами. Через війну програма синтезу певного білка зникає.

У 2006 р. за пояснення дії механізму РНК-інтерференції два американські дослідники були удостоєні Нобелівської премії з фізіології та медицини. Створення регуляторів експресії генів на основі інтерферуючих РНК відкрило великі можливості для одержання широкого спектру високоефективних нетоксичних препаратів, що пригнічують експресію практично всіх, зокрема пухлинних та вірусних генів.

Правильні мутації

Увагу фахівців давно привертають і методи мутагенної дії на ДНК за допомогою олігонуклеотидів або їх похідних. У разі успіху може стати реальним, що сьогодні здається фантастикою: корекція дефектних генетичних програм.

Експериментально вже доведено, що за допомогою коротких олігонуклеотидів можна вносити до генетичних програм точкові мутації. Як це здійснити? Мутагенні олігонуклеотиди, що містять неправильні нуклеотидні блоки, вводяться в клітину, де вони з'єднуються з ДНК. У результаті деяких ділянках нуклеотидних послідовностей з'являються «неправильні», т. е. некомплементарні, пари підстав, як і сприймається клітинної системою репарації («ремонту») ДНК як ушкодження. Нуклеотиди у подібній парі замінюються репаративними ферментами таким чином, щоб вона стала «правильною», комплементарною. При цьому заміна може відбуватися як в олігонуклеотидній послідовності, так і в клітинній ДНК.

У разі маємо справу зі зміною генетичної програми, т. е. з мутацією. І хоча ефективність подібного мутаційного процесу в цілому невелика, він може бути використаний стосовно нових клітинних технологій. Наприклад, стовбурові клітини хворого з будь-яким спадковим порушенням можна обробити вибірковим мутагеном, а потім відібрати ті з них, у яких відбулася потрібна мутація (тобто клітини з «виправленою» генетичною програмою), розмножити та ввести в організм.

1967 р. Опубліковано першу роботу з олігонуклеотидів - ген-спрямованих біологічно активних речовин

Таким чином, існуючі на сьогоднішній день олігонуклеотиди здатні регулювати «роботу» генів на різних рівнях. Так, вищезгадані антисенсові олігонуклеотиди та інтерферуючі РНК працюють на стадії синтезу білка, впливаючи на матричні РНК - інформаційні молекули, в яких відбувається складання поліпептидних ланцюжків. Антигенні олігонуклеотиди, що утворюють комплекси з ДНК, пригнічують експресію генів - утворення самих матричних РНК, а олігонуклеотиди-аптамери можуть, подібно до антитіл, утворювати зв'язки з певними білками, блокуючи їх. Крім того, деякі олігонуклеотиди здатні стимулювати роботу імунної системи - сьогодні їх використовують як компоненти вакцин.

В даний час розробку та синтез олігонуклеотидів та їх аналогів ведуть великі дослідницький та індустріальний сектори. Так, минулого року лише обсяг ринку олігонуклеотидів, призначених для дослідних цілей, перевищив 800 млн. доларів! Наразі розроблено та синтезовано десятки нових видів хімічно модифікованих олігонуклеотидів, йдуть випробування низки противірусних та протизапальних препаратів, отриманих на їх основі. Дослідження такого роду в Росії зараз проводяться в основному в Інституті хімічної біології та фундаментальної медицини СО РАН, де працюють учні та послідовники академіка Д. Г. Кнорре.

Ось така плідність ідеї, що виникла в Сибірському відділенні сорок років тому, була доведена самим життям. Використовуючи як базові структури для створення ген-спрямованих біологічно активних речовин короткі фрагменти нуклеїнових кислот, можна швидко розробити та впровадити у виробництво специфічні лікарські препарати практично проти будь-якого вірусу. Для цього потрібно лише розшифрувати нуклеотидну послідовність вірусних генів, що нескладно зробити за допомогою сучасних технологій. Цей універсальний підхід має велике майбутнє: результати досліджень останніх років, зокрема щодо спрямованого мутагенезу, дозволяють розраховувати на появу незабаром ефективних ліків для боротьби із захворюваннями, які досі вважаються невиліковними.

«Антисмислова» РНК (Antisense RNA), яку передбачається використовувати як лікарський засіб, являє собою короткий (15-20-нуклеотидів) олігонуклеотид, який може зв'язуватися з комплементарною їй певною ділянкою мРНК і інгібувати трансляцію кодованого їй білка, пригнічуючи тим самим (Рис.2).

Терапевтичний ефект синтетичних «антисмислових» олігонуклеотидів залежить від специфічності їх гібридизації з доступним сайтом мРНК-мішені, стійкості до дії клітинних нуклеаз та наявності системи доставки в клітину. 15-20-нуклеотидні послідовності гібридизуються з унікальними мРНК із досить високою специфічністю. Потенційні сайти-мішені визначають тестуванням набору «антисмислових» олігонуклеотидів з використанням культури клітин, що синтезують мРНК-мішень. Для цього проводять електрофоретичний поділ клітинних білків, які включають радіоактивну мітку під час трансляції, і за допомогою радіоавтографії встановлюють, у присутності якого з «антисмислових» олігонуклеотидів знижується синтез певного білка. Жодних загальних критеріїв вибору найкращих сайтів-мішеней у різних РНК-транскриптах не існує. Ефективними можуть бути олігонуклеотиди, комплементарні 5"- або 3"-кінцям мРНК, межам екзонів та інтронів і навіть дволанцюжковим областям. Антисенсові олігонуклеотиди можуть руйнуватися внутрішньоклітинними нуклеазами, тому важливо захистити їх від дії останніх так, щоб вони не втратили здатності до гібридизації з мішенню. Для цього можна модифікувати певним чином піримідинові основи, рибоз або дезоксирибозу (рис.3). Так, у найбільш широко застосовуються зараз антисмислових олігонуклеотидів вільний атом кисню фосфодіефірного зв'язку замінений на групу SH (рис. 3Б ), внаслідок чого утворюється тіофосфатний зв'язок. Модифіковані таким чином олігонуклеотиди розчиняються у воді, несуть негативний заряд і не розщеплюються під дією ендонуклеазу. При гібридизації з сайтом-мішенню вони утворюють дуплекси, які активують рибонуклеазу (РНКазу), ендогенний фермент, що розщеплює мРНК у такій гібридній молекулі. Проведено перші клінічні випробування таких олігонуклеотидів – лікарських засобів «першого покоління». Мішенями є РНК цитомегаловірусу, вірусу імунодефіциту людини, а також мРНК генів, відповідальних за розвиток раку, хвороб кишківника та інших захворювань.

Синтезовані «антисмислові» олігонуклеотиди з фосфорамідитним та поліамідним (пептидним) зв'язками - пептидні нуклеїнові кислоти (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3 В і Г ). Такі молекули дуже стійкі до дії нуклеазу. Хімічні групи, приєднані до 2"-вуглецевого атома цукрового залишку та С-5-атому піримідинів, також захищають «антисмислові» олігонуклеотиди та полегшують їх зв'язування з сайтом-мішенню (рис. 3). 2Ді Е ). Усі переваги цих та інших модифікацій зараз інтенсивно вивчаються.

Проникнення «антисмилових» олігонуклеотидів у клітину можна значно полегшити, помістивши їх у ліпосоми. Така високоефективна система доставки дозволяє використовувати антисмислові олігонуклеотиди в невеликих концентраціях. Якщо ж кон'югувати ліпосоми з антитілами, специфічними до епітопів певних клітин тих чи інших органів, можна буде здійснювати адресну доставку «антисмислових» олігонуклеотидів.

Проведені доклінічні випробування виявили, що «антисмислові» олігонуклеотиди є дуже ефективними лікарськими засобами. Вивчено можливість їх застосування для лікування стенозу коронарих та сонних артерій, що призводить до інфарктів та інсультів. У цих випадках часто вдаються до ангіопластики, розширення артерій за допомогою балонного катетера, але приблизно у 40% хворих через 6 місяців знову виникають стенози, оскільки ангіопластика стимулює проліферацію гладких клітин і секрецію міжклітинної речовини у внутрішній шар артерії в місці її розширення. В одному з експериментів в сонні артерії щурів після ангіопластики вводили антисмислові олігонуклеотиди з тіофосфатними зв'язками, комплементарні мРНК, які кодують важливі для клітинного циклу ссавців білки; в результаті частота повторних стенозів зменшилась на 90%. Проліферація гладких клітин відбувається також при атеросклерозі, цукровому діабеті, ускладненнях після коронарного шунтування. Ймовірно, всі ці стани можна буде контролювати аналогічними способами.

«Антисмилові» олігонуклеотиди можна застосовувати і для лікування вірусних інфекцій та малярії. Крім того, результати І фази клінічних випробувань лікування хвороби Крона за допомогою орального введення «антисмислового» олігонуклеотиду проілюстрували чітко виражений терапевтичний ефект без побічних ефектів. У цьому випадку мРНК-мішень кодувала міжклітинний адгезії типу 1, який виробляється надміру у пацієнтів з хворобою Крона. Передбачається дослідити ефективність цього ж олигонуклеотида для терапії інших запальних захворювань, наприклад ревматоїдного артриту, псоріазу та виразкового коліту.

В принципі «антисмислові» олігонуклеотиди можуть утворювати потрійну спіраль із хромосомною ДНК-мішенню та блокувати транскрипцію. Однак поки що специфічність «антигенних» олігонуклеотидів не відповідає стандартам, прийнятим для лікарських засобів.

04.07.2013 - 31.12.2013

Проведено систематичний аналіз сучасної літератури на тему дослідження. Встановлено послідовності найбільш перспективних, з погляду виконавців проекту, похідних олігонуклеотидів та їх аналогів, які мають проявляти противірусну та антибактеріальну активність.
Розроблено методики синтезу модифікованих олігонуклеотидів та їх кон'югатів з використанням автоматичних ДНК/РНК-синтезаторів або в режимі неавтоматизованого синтезу на твердотільному носії. Для дизайну олігонуклеотидних похідних із заданою функціональністю запропоновані різні підходи, в тому числі, засновані на прогностичному аналізі структури та стабільності дуплексів, що формуються за допомогою методу молекулярної динаміки. Запропоновано спосіб синтезу нових, раніше не описаних похідних олігонуклеотидів, що несуть модифікації по атому фосфору міжнуклеотидного фосфодіефірного угруповання.
Розроблено методику аналізу ефективності проникнення флуоресцеїн-мічених сполук у бактеріальні клітини. Показано, що позитивно заряджені похідні пептиду Flu-(LR)4G-аміду ефективно проникають і накопичуються в Pseudomonas aeruginosa, а ефективність проникнення до неї олігонуклеотидів без транспортного пептиду низька.
Всі розроблені при виконанні досліджень методики, як синтетичні, так і аналітичні, впроваджені в роботу лабораторії біомедичної хімії ІХБФМ СО РАН. Отримані теоретичні напрацювання використано у освітніх курсах.
Створена в лабораторії синтетична база для отримання, виділення та характеризації олігонуклеотидів є унікальною для РФ та близька до рівня найкращих світових науково-дослідних лабораторій відповідної спеціалізації. Залучення фахівців біологічного профілю робить лабораторію унікальною за потенціалом її науково-дослідної реалізації у напрямку розробки РНК-спрямованих противірусних та антибактеріальних препаратів.

Розгорнути

01.01.2014 - 31.12.2014

i) Оцінка антибактеріальної активності аналогів олігонуклеотидів/олігонуклеотидних кон'югатів щодо Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Оцінка антивірусної активності аналогів олігонуклеотидів/олігонуклеотидних кон'югатів щодо вірусу грипу WSN33/A/H1N1.
iii) Вибір послідовностей олігонуклеотидних аналогів-лідерів, які виявляють антибактеріальну або противірусну активність на необхідному рівні;
iv) Розробка протоколів синтезу олігонуклеотидних кон'югатів, що містять групи, які збільшують ефективність їх накопичення в еукаріотичних або бактеріальних клітинах
iv) Оцінка ефективності проникнення та накопичення розроблених сполук у бактеріальних та еукаріотичних клітинах.
v) підготовлена лабораторія;
vi) Статті в науковій періодиці, що індексується у Web of Science.
vii) Тези доповідей на конференціях;
viii) Свідоцтва про участь у освітніх курсах;
ix) Конференція;

Розгорнути

01.01.2015 - 31.12.2015

3.1 Антибактеріальна активність сполук, що містять послідовності-лідери щодо Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (у клітинній культурі);
3.2. Противірусна активність сполук, що містять послідовності-лідери, щодо вірусу грипу in vitro;

3.3. Технологічні та терапевтичні характеристики відібраних олігонуклеотидних аналогів та кон'югатів з урахуванням шляхів комерціалізації препаратів, у тому числі:

3.3.1 Список стандартизованих експериментальних методик для оцінки антибактеріальної та противірусної активності препаратів олігонуклеотидних аналогів in vitro (у культурі клітин) та in vivo (на тваринних моделях);

3.3.3 Відібрані олігонуклеотидні аналоги та кон'югати, які поряд з проявом високої антибактеріальної та противірусної активності здатні до ефективного проникнення та накопичення в клітинах, у тому числі:

3.3.2.1 Дані щодо проникнення в клітини та доставки модифікованих олігонуклеотидних аналогів та кон'югатів;
3.3.2.2 Оптимізований напівпрепаративний синтез, пре- та пост-синтетичні модифікації, виділення та кількісний контроль олігонуклеотидних аналогів, що виявляють антибактеріальну та противірусну активність;
3.3.2.3. Оцінка розроблених сполук з антибактеріальною та противірусною активністю з погляду комерційного використання.

3.4 Підготовлений фінальний звіт щодо Проекту;
3.5 Підготовлена лабораторія;

3.6 Тези доповідей на конференціях;
3.7 Свідоцтва про участь у освітніх курсах;

3.8 3 статті в науковій періодиці, що індексується в Web of Science

У більшості методів генної терапії ех vivo та in vivo використовуються клоновані генетичні конструкції, що відшкодовують функціональну форму білка, який не синтезується в організмі хворого або синтезується у дефектній формі. Однак багато захворювань людини (рак, запалення, вірусні та паразитарні інфекції) пов'язані, навпаки, з гіперпродукцією нормального білка. Для лікування таких станів розроблено терапевтичні

системи із використанням специфічних олігонуклеотидів. Такий невеликий олігонуклеотид може гібридизуватися зі специфічним геном або мРНК і знижувати рівень транскрипції або трансляції, зменшуючи тим самим кількість білка, що синтезується, відповідального за патологію. Олігонуклеотид, який гібридизується з самим геном і блокує його транскрипцію, називається «антигенним», а той, що гібридизується з відповідною мРНК, – «антисмисловим» (Antisense RNA). Для запобігання активації транскрипції специфічних генів можна також використовувати дволанцюгові олігонуклеотиди, що специфічно приєднуються до ДНК-зв'язуючих білків (білків-активаторів). Нарешті, для зменшення кількості певної мРНК і білка, що синтезується на ній, можна використовувати рибозими - природні РНК-послідовності, які зв'язуються зі специфічними молекулами РНК і розрізають їх.

У майбутньому лікарські засоби на основі нуклеїнових кислот, мабуть, знайдуть широке застосування, при цьому головним об'єктом наукових досліджень та клінічних випробувань будуть різні антисмислові олігонуклеотиди.

3.1.. «Антисмислові» олігонуклеотиди як лікарські засоби

5507 0

Цього можна досягти декількома способами: гібридизацією відповідного олігонуклеотиду зі специфічним геном або мРНК, блокуванням фактора транскрипції білка, зменшенням кількості мРНК внаслідок розщеплення РНК-ферментами тощо. Розглянемо принципи деяких із них.

Рибоолігонуклеотид, який зв'язується з певною мРНК і тим самим інгібує трансляцію білка, що нею кодується, називається «антисмислової» мРНК. Цей механізм використовують деякі бактерії регулювання генів (рис. 3.20). На практиці застосовують штучно сконструйовані гени, у яких ДНК-вставка знаходиться в такій орієнтації, щоб їх транскрипти були антисмисловими по відношенню до мРНК-мішені (рис. 3.21).

Рис. 3.20. Регулювання гена бактеріоферитину (bfr) за допомогою антисмислової РНК

Рис. 3.21. Інгібування трансляції мРНК синтетичним антисмисловим олігонуклеотидом

Було показано, що можливе використання синтетичних антисмислових олігонуклеотидів, проте їх терапевтичний ефект сильно залежатиме від їх стійкості до дії клітинних нуклеаз, системи доставки та специфічності їх гібридизації. Для визначення найбільш ефективних сайтів-мішеней на специфічній мРНК проводять тестування набору антисмислових олігонуклеотидів довжиною 15-20 основ з культурою клітин, що синтезують мРНК-мішень. Склад синтезованих білків визначають електрофорезом та встановлюють, введення якого олігонуклеотиду призводить до зниження синтезу білка-мішені.

Для захисту від нуклеазного розщеплення синтезуються модифіковані олігонуклеотиди, які не втратили здатність гібридизуватися. На рис. 3.22 наведено структури модифікованих нуклеотидів, ефективність яких інтенсивно вивчається. Наприклад, показано, що олігонуклеотиди із заміною вільного кисню фосфодіефірного зв'язку на сірку (структура б) ефективно гібридизуються з комплементарною РНК-мішенню і отримані дуплекси РНК-ДНК активують внутрішньоклітинну рибонуклеазу Н.

Цей ендогенний фермент гідролізує РНК-послідовність у таких гібридах. З такими олігонуклеотидами вже проведено багатообіцяючі клінічні випробування, в яких мішенями були РНК цитомегаловірусу, ВІЛ, деяких РНК, відповідальних за розвиток раку.

Рис. 3.22. Модифікації олігонуклеотидів: а - нормальний фосфодіефірний зв'язок; б - тіофосфатний зв'язок; в - фосфамідний зв'язок; г - 2"-0-метилрибоза; д - С-5-пропінілцитозин

Для ефективної доставки антисмислових олігонуклеотидів їх часто пакують у ліпосоми, у свою чергу модифіковані специфічними лігандами, що забезпечують адресну доставку (такий прийом ми вже зустрічали, коли розглядали способи невірусної доставки терапевтичних генів). На даний час проведено низку випробувань та показано високу терапевтичну ефективність антисмислових олігонуклеотидів для пригнічення небажаної проліфірації гладком'язових клітин (ускладнення після ангінопластики, коронарного шунтування, атеросклероз), для лікування вірусних інфекцій та малярії.

Принцип дії та будова рибозимів - природних РНК, що мають нуклеазну активність, показаний на рис. 3.23.
Виявлено, що ці коротколанцюгові РНК здатні ефективно пригнічувати експресію вірусних генів, онкогенів, факторів росту та інших терапевтично важливих генів, розщеплюючи їх мРНК. Модифікуючи субстрат-зв'язуючу послідовність, можна отримувати рибозими, специфічні до певної мРНК. Рибозими можна синтезувати безпосередньо в клітині транскрипцією синтетичного олігодезоксирибонуклеотиду, що кодує каталітичний домен і фланкуючі його ділянки, що гібридизуються.

Рис. 3.23. Розщеплення мРНК під впливом рибозимів. Стрілка показує сайт розщеплення

Такий олігонуклеотид вбудовують в еукаріотичний вектор, що експресує, і поміщають в клітину. РНК, що утворюється, мимоволі набуває активної конформації, так званої форми «головки молотка». Безліч рибозимів різної структури та активності синтезовано хімічно. Наприклад, в лабораторії нуклеїнових кислот Інституту хімічної біології та експериментальної медицини СО РАН (Новосибірськ) проводяться багаторічні дослідження з отримання синтетичних рибозимів, що мають підвищену активність і стабільність.

Для підвищення захисту від передчасного розщеплення внутрішньоклітинними нуклеазами отримують різні похідні рибозимів - з метильованими 2"-гідроксильними (див. рис. 3.22, г) групами, бінарні конструкції і т.п. Будова молекули рибозиму істотно впливає на його ефективність. На рис. 3.24 показана кінетика розщеплення мРНК гена множинної лікарської стійкості mdr1 за допомогою синтезованих рибозимів різної структури.

Рис. 3.24. Розщеплення 190-ланкового 5"-кінцевого фрагменту MDR1 мРНК модифікованими бінарними (1,3) та повнорозмірними (2,4) рибозимами: а - структура РНК з виділеним специфічним сайтом; б - накопичення продуктів розщеплення (матеріали надані А.Г. Веньяміновою, ІБХіФМ, Новосибірськ)

Особливе місце у молекулярної терапії займають звані методи активування проліків. Наприклад, одним із способів генної терапії раку є знищення пухлинних клітин за допомогою активованого похідного ганцикловіру (GCV, похідне гуанозину), продукту гена тимідинкінази, вже згаданого нами вірусу простого герпесу HSVtk.

Пухлинні клітини трансфецируют in vivo геном HSVtk під активним промотором і через кілька днів вводять ганцикловір, який фосфорилюється вірусною тимідинкіназою до монофосфату, а потім кіназ клітини-господаря до трифосфату. Це похідне інгібує ДНК-полімеразу і зупиняє синтез ДНК, що призводить до загибелі клітин, що проліфілюють. Через міжклітинні контакти ганцикловіртрифосфат проникає в сусідні немодифіковані клітини і таким чином знищується додатково до десятка пухлинних клітин.

Ген, що призводить до загибелі власної клітини, називається геном «самовбивства» (у нашому випадку це ген тимідинкінази), а термін «пролік» відноситься до неактивної форми лікарської речовини (в даному випадку це ганцикловір). Цей підхід був використаний і для створення інших варіантів комбінації генактиватор-пролік, але ефективність системи GCV-HSVtk вже доведена низкою доклінічних випробувань.

Генна терапія є новою лікувальною дисципліною, становлення якої відбувається на наших очах. Незважаючи на деякі успіхи і перспективні перспективи, існує низка проблем, які ще належить подолати.

Частина проблем лежить далеко не в площині медицини та молекулярної біології. Йдеться про проблеми етичних та політичних. Як ви вже помітили, ми розглядали методи генетичної терапії лише соматичних клітин. Це означає, що зроблені корекції обмежуються певним органом чи тканиною, «виправлені» гени нічого очікувати передаватися наступному поколінню. Зміни генотипу зародкових клітин (сперматозоїдів чи яйцеклітин) чи запліднених клітин мають передаватися з покоління до покоління.

В даний час генна терапія соматичних клітин віднесена до стандартних методів медичного втручання. На противагу цьому генна терапія зародкових клітин є технологічно набагато складнішою, проблематичнішою і непередбачуваною. Тому експерименти у цій галузі у багатьох країнах заборонені.

Наприкінці 80-х років. США було встановлено правила, регулюючі випробування у сфері генетичної терапії соматичних клітин. Вони гарантують неупереджений та репрезентативний відбір хворих та їх поінформованість (наскільки небезпечне лікування, яка ймовірність його успіху та ін.), конфіденційність відомостей про хворих та проведені дослідження, здійснення всіх маніпуляцій належним чином без заподіяння шкоди, як конкретним хворим, так і людській попу загалом.

Оскільки лікування соматичних клітин призводить до поліпшення стану та значного продовження життя хворих на генетичні захворювання, але «покращений» ген не передається у спадок, існує думка, що це призведе до накопичення генетичних захворювань у людській популяції. Однак, за даними популяційної генетики, для суттєвого підвищення частоти шкідливого гена в результаті ефективного лікування потрібні тисячі років.

Н.А. Воїнів, Т.Г. Волова