Сутність фагоцитозу можна описати буквально кількома словами. У цьому процесі спеціальні клітини-фагоцити «обчислюють», пожирають і перетравлюють шкідливі частки, які у організм, переважно інфекції. Мета явища полягає в тому, щоб захистити нас від потенційних патогенів, токсинів тощо. А як саме здійснюється механізм фагоцитозу? Він проходить у кілька етапів, про які буде детальніше розказано нижче.

Етапи фагоцитозу:

Хемотаксис

Шкідливий об'єкт проникає в організм, і він недовго залишається там непоміченим. Цей об'єкт, чи то бактерія, стороннє тіло чи щось інше, виділяє особливі речовини (хемоаттрактанти) і прямо контактує з кров'ю чи тканинами. Все це повідомляє організм про присутність всередині нього агресора.

Виникає каскад біохімічних реакцій. На першій стадії фагоцитозу опасисті клітини викидають у кров спеціальні сполуки, що викликають реакцію запалення. Початок запального процесу «пробуджує» від стану спокою макрофаги та інші клітини-фагоцити. Нейтрофіли, вловивши присутність хемоаттрактантів, швидко виходять із крові в тканини і поспішають мігрувати до запального вогнища.

Складно це описати, а ще складніше собі це уявити, але проникнення патогену в організм веде до запуску справжнього ефекту доміно, що включає сотні (!) Різних фізіологічних явищ, що проходять на клітинному та субклітинному рівнях. Стан імунної системи цьому етапі фагоцитозу можна порівняти зі станом потривоженого бджолиного вулика, що його численні жителі готуються атакувати кривдника.

Нейтрофіл - мігруючий фагоцит

Послідовність фагоцитозу продовжується другою стадією – реакцією адгезії. Фагоцити, що підійшли до потрібного місця, простягають до патогену свої відростки, вступають з ним в контакт і розпізнають його. Вони не поспішають відразу нападати і спочатку вважають за краще переконатися, чи не помиляються вони на рахунок «чужинця». Розпізнання шкідливого агента відбувається з допомогою спеціальних рецепторів лежить на поверхні мембран фагоцитів.

Активація мембрани

На третій стадії фагоцитозу в клітинах-захисниках відбуваються невидимі реакції, які готують їх до захоплення та знищення патогену.

Занурення

Мембрана фагоциту – це текуча, пластична субстанція, яка може змінювати форму. Що вона і робить, коли клітина стикається зі шкідливим об'єктом. На фото видно, що фагоцит простягає до чужорідної частки свої щупальця. Потім він поступово розтікається навколо неї, наповзає на неї і її повністю захоплює.

Фагоцит простягає відростки до патогену

Освіта фагосоми

Коли фагоцит охоплює частинку з усіх боків, його мембрана замикається зовні, а всередині клітини залишається закрита бульбашка з атакованим об'єктом усередині. Таким чином, клітина начебто ковтає частинку. Ця бульбашка носить назву фагосоми.

Формування фаголізосоми (злиття)

Поки проходили інші етапи фагоцитозу, всередині фагоциту готувалася до використання його зброя – органели-лізосоми, що містять «травні» ферменти клітини. Як тільки бактерія або інший шкідливий об'єкт виявився полонений клітиною-захисником, до неї наближаються лізосоми. Їхні мембрани зливаються з оболонкою, що обволікає частинку, і їх вміст виливається всередину цього «мішка».

Це найдраматичніший момент у всьому механізмі фагоцитозу. Захоплений об'єкт перетравлюється та розщеплюється фагоцитом.

Видалення продуктів розщеплення

Все, що залишилося від убитої бактерії або іншої перевареної частинки, видаляється з клітини. Колишня фаголізосома, що є мішечком з продуктами деградації, підходить до зовнішньої мембрани фагоциту і зливається з нею. Так із клітини видаляються залишки поглиненого об'єкта. Послідовність фагоцитозу завершує

Фагоцитоз (від грец. phago – пожираю і cytos – клітина) є процесом поглинання та перетравлення антигенних речовин, у тому числі мікроорганізмів, клітинами мезодермального походження, названими фагоцитами. І. І. Мечников розділив фагоцити на макрофаги та мікрофаги. В даний час макро-і мікрофаги об'єднані в єдину систему макрофагів (СМФ). До цієї системи відносять:

• тканинні макрофаги - епітеліоїдні клітини,
• зірчасті ретикулоендотеліоцити (клітини Купфера),
• альвеолярні та перитонеальні макрофаги, що знаходяться в альвеолах та порожнини очеревини,
• білі відросткові епідермоцити шкіри (клітини Лангерганса) та ін.

До мікрофаг відносяться:

• нейтрофіли,
• еозинофіли,
• базофілі.

Функції макрофагівнадзвичайно різноманітні. Вони перші реагують на чужорідну речовину, будучи спеціалізованими клітинами, що поглинають і знищують в організмі чужорідні субстанції (кліти, що відмирають, ракові клітини, бактерії, віруси та інші мікроорганізми, антигени, неметаболізовані неорганічні речовини). Крім того, макрофаги виробляють багато біологічно активних речовин – ферменти (у тому числі лізоцим, пероксидазу, естеразу), білки комплементу, імуномодулятори типу інтерлейкінів. Наявність на поверхні макрофагів рецепторів до імуноглобулінів (Am) та комплементу, а також система медіаторів забезпечує їхню взаємодію з Т- та В-лімфоцитами. При цьому макрофаги активують захисні функції Т-лімфоцитів. Завдяки наявності рецепторів до комплементу та Am, а також Аг системи гістосумісності (HLA) макрофаги беруть участь у зв'язуванні та розпізнаванні антигенів. Таким чином, фагоцитам притаманні три функції:

• захисна, пов'язана з очищенням організму від інфекційних агентів, продуктів розпаду тканин тощо;
• що представляє, що полягає у презентації лімфоцитів антигенних епітолів на мембрані фагоциту;
• секреторна, пов'язана з секрецією лізосомних ферментів та інших біологічно активних речовин – цитокінів, які відіграють важливу роль імуногенезі.

Розрізняють такі послідовно протікаючі стадії фагоцитозу.

• Хемотаксис- Цілеспрямоване пересування фагоцитів у напрямку хімічного градієнта хемоаттрактантів у навколишньому середовищі. Здатність до хемотаксису пов'язана з наявністю на мембрані специфічних рецепторів для хемоаттрактантів (об'єктів фагоцитозу), якими можуть виступати бактерії, продукти деградації тканин організму та ін.
• Адгезія(прикріплення) також опосередкована відповідними рецепторами, але може протікати відповідно до законів неспецифічної фізико-хімічної взаємодії. Відбувається адсорбція частинок поверхні макрофага.
• Ендоцитоз(Захоплення) - відбувається інвагінація клітинної мембрани, захоплення чужорідної частки та занурення її в протоплазму. Внаслідок ендоцитозу утворюється фагоцитарна вакуоль – фагосома(Т. Е. Бульбашка в протоплазмі навколо поглиненої частинки).
• Внутрішньоклітинне перетравлення– починається в міру поглинання об'єктів, що фагоцитуються. Відбувається злиття фагосоми з лізосомою фагоциту, що містить десятки ферментів, та утворення фаголізосоми (деструкція) захопленої частинки ферментами. При поглинанні частинки, що належить самому організму (наприклад, клітина, що загинула або її частини, власні білки), відбувається розщеплення її ферментами фаголізосоми до неантигенних речовин (амінокислоти, жирні кислоти, нуклеотиди, моносахара). Якщо поглинається чужорідна частка, то ферменти фаголізосоми не в змозі розщепити речовину до неантигенних компонентів. У таких випадках фаголізосома з частиною антигену, що залишилася і зберегла чужорідність, передається макрофагом Т- і В-лімфоцитам, тобто включається специфічна ланка імунітету.

Секреторна функціяполягає у секреції фагоцитами біологічно активних речовин – цитокінів – це інтерлейкін-1 та інтерлейкін-2, які є клітинними медіаторами, що надають регулюючу дію на проліферацію, диференціацію та функції фагоцитів, лімфоцитів, лімфобластів та інших клітин. Макрофаги продукують та секретують такі важливі регуляторні фактори, як простагландини, лейкотрієни, циклічні нуклеотиди з широким спектром біологічної активності. Крім того, макрофаги синтезують і секретують ряд продуктів, що мають антибактеріальну, антивірусну та цитотоксичну активність (кисневі радикали О2-Н2О2, лізоцим, інтерферон та ін.).

Фагоцитоз посилюється антитілами-опсонінами, оскільки зв'язаний або антиген легше адсорбується на поверхні фагоциту, внаслідок наявності у останнього рецепторів до цих антитіл. Таке посилення фагоцитозу антитілами названо опсонізацією, тобто. підготовкою мікроорганізмів до захоплення фагоцитами Фагоцитоз опсонізованих антигенів називають імунним.

Для характеристики активності фагоцитозу введено фагоцитарний показник.Для визначення його підраховують під мікроскопом кількість бактерій, поглинених одним фагоцитом. Користуються також опсонофагоцитарним індексом, Що представляє відношення фагоцитарних показників, отриманих з імунною та не імунною сироваткою. Фагоцитарний показник та опсонофагоцитарний індекс використовують у клінічній імунології для оцінки стану імунітету та імунного статусу.

Фагоцитоз відіграє велику роль у протибактеріальному, протигрибковому та противірусному захисті, підтримці резистентності організму до чужорідних речовин. Фагоцити також надають активуючу та супресивну дію на лімфоцити, беруть участь у реанімації імунологічної толерантності, антиінфекційного, трансплантаційного та протипухлинного імунітету, деяких форм алергії (ГЗТ).

Процес фагоцитозу (поглинання твердофазного об'єкта) складається із п'яти стадій.

• 1. Активація (посилення енергетичного метаболізму). Факторами активації та хемотаксису є бактеріальні продукти (ЛПС, пептиди), компоненти комплементу (С3 та С5), цитокіни та антитіла.
• 2. Хемотаксис.
• 3. Адгезія.
• 4. Поглинання.
• 5. Результат фагоцитозу.

Адгезія пов'язана з наявністю ряду рецепторів на поверхні фагоцитів (до Fc-фрагментів антитіл, компонентів комплементу, фібронектину), що забезпечують міцність рецептор-опосередкованих взаємодій опсонінів, що обволікають мікроорганізми та обмежують їх рухливість (антитіла, С3в, фібронектин).

Фагоцити мають амебоподібні псевдоподії. При поглинанні утворюється фагосома з поглиненим об'єктом (бактерією), до неї приєднується і зливається лізосома, що містить літичні ферменти, утворюється фаголізосома.

Можливо три результати фагоцитозу:

• - завершений фагоцитоз;
• - незавершений фагоцитоз;
• - Процесинг антигенів.

Завершений фагоцитоз-повне перетравлення мікроорганізмів у клітині-фагоциті.

У процесі фагоцитозу відбувається "окислювальний вибух" з утворенням активних форм кисню, що забезпечує бактерицидний ефект.

До однієї з найважливіших функцій макрофагів (поряд з хемотаксисом, фагоцитозом, секрецією біологічно активних речовин) є переробка (процесинг) антигену та подання його імунокомпетентних клітин за участю білків головної системи гістосумісності (МНС) класу 2.

Фагоцитоз - не тільки знищення чужорідного, а й уявлення антигену для запуску імунних реакцій та секреції медіаторів імунних та запальних реакцій. Система макрофагів- центральне ланка як природної резистентності (видового імунітету), а й грає значної ролі у набутому імунітеті, кооперації клітин у імунному відповіді.

Запалення як захисна реакція організму на різні ушкодження тканин виникло на вищому ступені еволюції, ніж фагоцитоз і характерно для високоорганізованих організмів, що мають кровоносну та нервову системи.

Інфекційне запалення супроводжується різними судинними та клітинними (включаючи фагоцитоз) реакціями, а також запуском цілого ряду медіаторів запальних реакцій (гістаміну, серотоніну, кінінів, білків гострої фази запалення, лейкотрієнів та простагландинів, цитокінів).

Багато бактеріальних продуктів активують клітини макрофагально-моноцитарної системи та лімфоцити, що відповідають на них виділенням біологічно активних продуктів-цитокінів, зокрема інтерлейкінів. Їх можна характеризувати як медіатори клітинних імунних реакцій. У запальних реакціях основну роль має інтерлейкін-1 (ІЛ-1), що стимулює лихоманку, що підвищує проникність судин та адгезивні властивості ендотелію, що активує фагоцити.

Гарячка. Підвищення температури тіла – захисна реакція організму, що погіршує умови для розмноження багатьох мікроорганізмів, активує макрофаги, прискорює кровотік та посилює обмінні процеси в організмі.

Бар'єрні функції лімфовузлів. За словами П.Ф.Здродовского (1969) лімфовузли- своєрідний біологічний фільтр для збудників, що переносяться з лімфою. Тут мікроорганізми, що проникли через шкіру або слизові і занесені струмом лімфи, затримуються і піддаються дії макрофагів і активованих лімфоцитів.

Система комплементу-комплекс білків і глікопротеїдів сироватки крові людини та хребетних тварин (їх більше 20). Окремі компоненти опосередковують процеси запалення, опсонізацію чужорідних фрагментів для подальшого фагоцитозу, беруть участь поряд з макрофагами у безпосередньому знищенні мікроорганізмів та інших чужорідних клітин (лізис бактерій та вірусів). У разі фізіологічної норми компоненти системи комплементу перебувають у неактивної формі. Відомі три шляхи активації системи комплементу-класичний, альтернативний і з використанням С1-шунта.

Класичний шлях-каскад протеазних реакцій з компонента С1q до С9, реалізується за наявності антитіл до антигену. З комплексом "антиген-антитіла" взаємодіє компонент С1q, потім С4, слідом - С2. Утворюється комплекс “антиген-антитіла-С1С4С2”, з ним з'єднується С3 (центральний компонент системи) та запускається ланцюг активації з ефекторними функціями (опсонізація та лізис бактерій, активація системи макрофагів, запалення).

Альтернативний шлях реалізується при первинному контакті зі збудником (коли ще немає антитіл). Він індукується ЛПС та іншими мікробними антигенами. С1, С4, С2 не беруть участь, альтернативний та класичний шляхи стуляються на рівні С3.

Система інтерферонів.

Інтерферони- синтезовані різними клітинами організму глікопротеїди широкого спектра біологічної активності (передусім антивірусної), швидка відповідь організму отримання клітинами неспецифічного сигналу чужорідності. Існує ціла система інтерферонів, які розділені на альфа, бета та гамма підтипи з вираженою гетерогенністю властивостей. Противірусна дія проявляється у здатності пригнічувати внутрішньоклітинне розмноження ДНК-і РНК-вірусів (насамперед у результаті блокування синтезу вірусних макромолекул). Індукцію синтезу інтерферонів викликають віруси, бактерії, рикетсії, найпростіші, синтетичні сполуки.

Кілерні клітини.

У забезпеченні видового імунітету істотну роль належить Т-цитотоксичним лімфоцитам (Т-кілерам), а також головній системі гістосумісності (докладніше в наступних лекціях).

Т-кілери за поданням антигенів головної системи гістосумісності класу 1 розпізнають будь-які чужорідні антигени (включаючи мутантні, наприклад-ракові клітини), атакують і знищують їх.

Клітини NK (natural killer-натуральні кілери) мають важливе значення у підтримці генетичного гомеостазу та протипухлинному захисті, їх функції розпізнавання не залежать від представлення антигенів МНС (major histocompatibility complex) класу 1.

Системи неспецифічної резистентності та видового імунітету сприяють підтримці структурної та функціональної цілісності організму та є основою для формування набутого (специфічного) імунітету. Стикуючись цьому, вищому рівні, системи видового і набутого імунітету утворюють єдину і найефективнішу систему самозахисту організму від усього чужорідного.

Імунна система.

Імунна система-сукупність органів, тканин і клітин, що забезпечують клітинно-генетичну сталість організму. Принципи антигенної (генетичної) чистоти ґрунтуються на розпізнаванні "свого чужого" і значною мірою обумовлені системою генів та глікопротеїдів (продуктів їх експресії) - головним комплексом гістосумісності (MHC), у людини часто званої системою HLA (human leucocyte antigens). На лейкоцитах людини чітко експресовані білки МНС, з допомогою дослідження лейкоцитів типують антигени МНС.

Органи імунної системи.

Виділяють центральні (кістковий мозок-кровотворний орган, вилочкова залоза або тимус, лімфоїдна тканина кишечника) та периферичні (селезенка, лімфатичні вузли, скупчення лімфоїдної тканини у власному шарі слизових оболонок кишкового типу) органи імунітету.

Клітини-попередники імунокомпетентних клітин продукуються кістковим мозком. Деякі нащадки стовбурових клітин стають лімфоцитами. Лімфоцити поділяють на два класи-Т і В. Попередники Т-лімфоцитів мігрують до тимусу, де дозрівають у клітини, здатні брати участь в імунній відповіді. У людини В-лімфоцити дозрівають у кістковому мозку. У птахів незрілі В-клітини мігрують до сумки (бурсу) Фабриціуса, де досягають зрілості. Зрілі В- та Т-лімфоцити заселяють периферичні лімфовузли. Таким чином, центральні органи імунної системи здійснюють утворення та дозрівання імунокомпетентних клітин, периферичні органи забезпечують адекватну імунну відповідь на антигенну стимуляцію-"обробку" антигену, його розпізнавання та клональну проліферацію лімфоцитів - антигензалежне диференціювання.

Імунітет: механізми розгортання

Клітини та молекули діють злагоджено, підтримуючи один одного на різних етапах розвитку імунної відповіді.

Неспецифічні механізми

На першому етапі зіткнення з чужорідним антигеном запускається неспецифічний патологічний захисний процес - запалення, що супроводжується фагоцитозом, виділенням медіаторів запалення - гістаміну, серотоніну, цитокінів і т. п. Фагоцити (макрофаги) поглинають антигени і контактують з лим Антигенні детермінанти. Т-хелпери запускають розмноження (виділяючи специфічні білкові речовини - інтерлейкіни) специфічних для даного антигену клонів Т-кілерів і В-лімфоцитів з передіснуючих стовбурових клітин, які пройшли перевірку на толерантність в ембріональному періоді (клонально-селекціон.

Запалення (лат. inflammatio) - це комплексний, місцевий та загальний патологічний процес, що виникає у відповідь на пошкодження (alteratio) або дію патогенного подразника і що проявляється в реакціях (exudatio та ін), спрямованих на усунення продуктів ушкодження, а якщо можливо, то й агентів (подразників), а також що призводить до максимального для цих умов відновлення (proliferatio та ін.) у зоні ушкодження.

Схема розвитку запалення. Під дією шкідливого фактора відбувається виділення макрофагом прозапальних цитокінів, які залучають в осередок запалення інші клітини, в результаті агрегації яких або виділення ними активних речовин відбувається порушення цілісності тканини.

Фагоцитоз (Фаго – пожирати і цитос – клітина) – процес, при якому спеціальні клітини крові та тканин організму (фагоцити) захоплюють та перетравлюють збудників інфекційних захворювань та відмерлі клітини. Здійснюється двома різновидами клітин: зернистими лейкоцитами (гранулоцитами), що циркулюють у крові, і тканинними макрофагами. Відкриття фагоцитозу належить І. І. Мечникову, який виявив цей процес, проробляючи досліди з морськими зірками та дафніями, вводячи до них організми сторонні тіла. Наприклад, коли Мечников помістив у тіло дафнії суперечку грибка, він помітив, що у неї нападають особливі рухливі клітини. Коли ж він запровадив дуже багато суперечок, клітини не встигли їх переварити, і тварина загинула. Клітини, що захищають організм від бактерій, вірусів, спор грибів та ін. Мечников назвав фагоцитами.

У людини розрізняють два типи фахових фагоцитів:нейтрофіли та моноцити (у тканині - макрофаги)

Основні етапи фагоцитарної реакції подібні клітин обох типів. Реакція фагоцитозу може бути поділена на кілька етапів:

1. Хемотаксис. У реакції фагоцитозу найважливіша роль належить позитивному хемотаксису. Як хемоаттрактанти виступають продукти, що виділяються мікроорганізмами та активованими клітинами в осередку запалення (цитокіни, лейкотрієн В4, гістамін), а також продукти розщеплення компонентів комплементу (С3а, С5а), протеолітичні фрагменти факторів згортання крові та фібринолізу (тромбін, імуноглобулінів та ін. Проте, "професійними" хемотаксинами служать цитокіни групи хемокінів.

Раніше інших клітин у вогнище запалення мігрують нейтрофіли, значно пізніше надходять макрофаги. Швидкість хемотаксичного переміщення для нейтрофілів і макрофагів можна порівняти, відмінності в часі надходження ймовірно пов'язані з різною швидкістю їх активації.

2. Адгезія фагоцитів до об'єкта.Зумовлена ​​наявністю на поверхні фагоцитів рецепторів для молекул, представлених на поверхні об'єкта (власних або пов'язаних із ним). При фагоцитозі бактерій або старих клітин організму господаря відбувається розпізнавання кінцевих сахаридних груп - глюкози, галактози, фукози, маннози та ін, які представлені на поверхні клітин, що фагоцитуються. Розпізнавання здійснюється лектиноподібними рецепторами відповідної специфічності, насамперед маннозв'язуючим білком та селектинами, присутніми на поверхні фагоцитів.

У тих випадках, коли об'єктами фагоцитозу є не живі клітини, а шматочки вугілля, азбесту, скла, металу та ін, фагоцити попередньо роблять об'єкт поглинання прийнятним для здійснення реакції, огортаючи його власними продуктами, у тому числі компонентами міжклітинного матриксу, який вони продукують.

Хоча фагоцити здатні поглинати різного роду " непідготовлені " об'єкти, найбільшої інтенсивності фагоцитарний процес досягає при опсонізації тобто. фіксації на поверхні об'єктів опсонінів до яких фагоцити мають специфічні рецептори - до Fc-фрагменту антитіл, компонентів системи комплементу, фібронектину і т.д.

3. Активація мембрани.На цій стадії здійснюється підготовка об'єкта до занурення. Відбувається активація протеїнкінази, вихід іонів кальцію з внутрішньоклітинних депо. Велике значення грають переходи золь-гель у системі клітинних колоїдів та актино-міозинові перебудови.

4. Занурення. Відбувається обволікання об'єкта

5. Утворення фагосоми.Замикання мембрани, занурення об'єкта із частиною мембрани фагоциту всередину клітини.

6. Утворення фаголізосоми.Злиття фагосоми з лізосомами, у результаті утворюються оптимальні умови для бактеріолізу та розщеплення вбитої клітини. Механізми зближення фагосоми та лізосом не зрозумілі, ймовірно є активне переміщення лізосом до фагосомів.

7. Кіллінг та розщеплення.Велика роль клітинної стінки клітини, що перетравлюється. Основні речовини, що беруть участь у бактеріолізі: перекис водню, продукти азотного метаболізму, лізоцим та ін. Процес руйнування бактеріальних клітин завершується завдяки активності протеаз, нуклеаз, ліпаз та інших ферментів, активність яких оптимальна при низьких значеннях рН.

8. Викид продуктів деградації.

Фагоцитоз може бути: завершеним (кілінг та перетравлення пройшло успішно), незавершеним (для ряду патогенів фагоцитоз є необхідним ступенем їх життєвого циклу, наприклад у мікобактерій та гонококів).

Активація комплементу.

Система комплементу працює як біохімічний каскад реакцій. Комплемент активується трьома біохімічними шляхами: класичним, альтернативним та лектиновим шляхом. Всі три шляхи активації роблять різні варіанти C3-конвертази (білка, що розщеплює С3). Класичний шлях (він був відкритий першим, але еволюційно є новим) вимагає антитіл для активації (специфічна імунна відповідь, набутий імунітет), тоді як альтернативний та лектиновий шляхи можуть бути активізовані антигенами без присутності антитіл (неспецифічна імунна відповідь, уроджений імунітет). Результат активації комплементу у всіх трьох випадках однаковий: C3-конвертаза гідролізує СЗ, створюючи C3a і C3b і викликаючи каскад подальшого гідролізу елементів системи комплементу та подій активації. У класичному шляху для активації С3-конвертази потрібне утворення комплексу С4b2a. Цей комплекс утворюється при розщепленні С2 та С4 С1-комплексом. С1-комплекс, у свою чергу, для активації повинен зв'язатися з імуноглобулінами класу М або G. C3b зв'язується з поверхнею хвороботворних мікроорганізмів, що призводить до більшої «зацікавленості» фагоцитів до зв'язаних із СЗb клітин (опсонізація). C5a - важливий хемоаттрактант, що допомагає залучати до району активації системи комплементу нові імунні клітини. І C3a, і C5a мають анафілотоксичну активність, безпосередньо викликаючи дегрануляцію опасистих клітин (як наслідок – виділення медіаторів запалення). C5b починає формування мембраноатакуючих комплексів (МАК), що складається з C5b, C6, C7, C8 та полімерного C9. МАК – цитолітичний кінцевий продукт активації системи комплементу. МАК формує трансмембранний канал, що викликає осмотичний лізис клітини-мішені. Макрофаги поглинають позначені системою комплементу хвороботворні мікроорганізми.

Класичний шлях

Класичний шлях запускається активацією комплексу С1 (він включає одну молекулу С1q і дві молекули С1r і С1s). Комплекс С1 зв'язується за допомогою С1q з імуноглобулінами класів М та G, пов'язаними з антигенами. Гексамерний C1q формою нагадує букет нерозкритих тюльпанів, «бутони» якого можуть зв'язуватися з Fc ділянкою антитіл. Для ініціації цього шляху достатньо єдиної молекули IgM, активація молекулами IgG менш ефективна і потребує більше молекул IgG.

С1q зв'язується прямо з поверхнею патогену, це веде до конформаційних змін молекули С1q і викликає активацію двох молекул серинових протеаз С1r. Вони розщеплюють С1s (теж серинову протеазу). Потім комплекс С1 зв'язується з С4 та С2 і потім розщеплює їх, утворюючи С2а та С4b. С4b і С2а зв'язуються один з одним на поверхні патогену і утворюють С3-конвертазу класичного шляху, С4b2а. Поява С3-конвертази призводить до розщеплення С3 С3а і С3b. С3b утворює разом із С2а і С4b С5-конвертазу класичного шляху.

Альтернативний шлях

Альтернативний шлях запускається гідролізом C3 прямо на поверхні патогену. В альтернативному шляху беруть участь фактори і D. З їх допомогою відбувається утворення ферменту СЗbВb. Стабілізує його та забезпечує його тривале функціонування білок P. Далі РС3bВb активує С3, в результаті утворюється С5-конвертаза та запускається утворення мембраноатакуючого комплексу. Подальша активація термінальних компонентів комплементу відбувається так само, як і за класичним шляхом активації комплементу.

Альтернативний шлях відрізняється від класичного наступним: при активації системи комплементу не потрібне утворення імунних комплексів, він відбувається без участі перших компонентів комплементу – С1, С2, С4. Він також відрізняється тим, що спрацьовує відразу після появи антигенів - його активаторами можуть бути бактеріальні полісахариди та ліпополісахариди, вірусні частинки, пухлинні клітини.

Лектиновий (манозний) шлях активації системи комплементу

Маннан (маннан - полімер маннози)-пов'язаний лектиновий шлях гомологічне класичному шляху активації системи комплементу. Цей шлях використовує маннан-зв'язуючий лектин (MBL)-білок, подібний до C1q класичного шляху активації, який зв'язується з манозними залишками та іншими цукроми на мембрані, що дозволяє розпізнавати різноманітні хвороботворні мікроорганізми. MBL - білок, що належить до колективної групи білків, яка виробляється печінкою і може активувати каскад комплементу, зв'язуючись із поверхнею патогену. MBL - 2-6-вершинна молекула, яка формує комплекс з MASP-I (Mannan-binding lectin Associated Serine Protease, MBL-пов'язана серинова протеаза) та MASP-II. MASP-I і MASP-II дуже схожі з C1r і C1s класичного шляху активації і, можливо, мають загального еволюційного попередника. Коли визначальні вуглеводи вершини MBL зв'язуються з певним чином орієнтованими манозними залишками на фосфоліпідному бислое хвороботворного мікроорганізму, MASP-I і MASP-II активуються і розщеплюють білок C4 на C4a і C4b, а білок С2 на C2a і C2b. хвороботворного мікроорганізму, формуючи C3-конвертазу, а C4a та C2b діють як хемоатрактанти.

Клітинна імунна відповідь

Вірус, що проник в організм, ендоцитується макрофагами і потім частково руйнується в ендоплазматичному ретикулумі (1). В результаті утворюються чужорідні фрагменти, які експонуються на поверхні клітин макрофагів (2). Ці фрагменти "презентуються" спеціальною групою мембранних білків (білки ГКГС). Комплекс із вірусного фрагменту та білка головного комплексу гістосумісності [ГКГС (МНС)] розпізнається та зв'язується Т-клітинами за допомогою специфічних (Т-клітинних) рецепторів. Серед величезної кількості Т-клітин лише деякі мають відповідний рецептор (3), зв'язування призводить до активації цих Т-клітин і появи їх селективних копій (4, "клональна селекція"). В активації Т-клітин беруть участь різні гормоноподібні Сигнальні білки, інтерлейкіни [МЛ (IL), див. 378]. Ці білки секретуються клітинами імунної системи, які активуються при зв'язуванні з Т-клітинами. Так, активовані макрофаги з презентованим вірусним фрагментом секретують IL-1 (5), а Т-клітини продукують IL-2 (6), який стимулює їх власне клональне копіювання та реплікацію Т-хелперних клітин.

Клоновані та активовані Т-клітини здійснюють різні функції в залежності від їх типу. Цитотоксичні Т-клітини (на схемі зеленого кольору) здатні пізнавати та зв'язувати ті клітини організму, які інфіковані вірусами та на своїх рецепторах ГКГС несуть фрагменти вірусу (7). Цитотоксичні Т-клітини секретують перфорин - білок, який робить проникною мембрану зв'язаної інфікованої клітини, що призводить до її лізису (8).

Т-хелпери (на схемі блакитного кольору), навпаки, зв'язуються з В-клітинами, які презентують на своїй поверхні фрагменти вірусу, пов'язані з білком ГКГС (9). Це веде до селективного клонування індивідуальних В-клітин та їх масованої проліферації, Інтерлейкін стимулює (10) дозрівання В-клітин - перетворення на плазматичні клітини (11), здатні синтезувати та секретувати антитіла (12)

У літературі описано багато методів кількісної оцінки фагоцитозу. Обсяг цієї книги не дозволяє докладно викласти всі з них, тому ми обмежимося лише описом деяких.

Матеріали та обладнання

Для роботи необхідно мати:

Цитратдекстрозний антикоагулянт: 8 г лимонної кислоти. 22 г тризаміщеного цитрату натрію (двоводного), 24,5 г глюкози розчиняють у 1 л води;

Розчин декстрозодекстрану: 4,5 г NaCl, 25 г глюкози, 30 г декстрану (відн. мовляв. маса 500 000) в 1 л;

Розчин хлористого амонію: 9 частин 0,83% хлористого амонію, 1 частина трис-НСl-буфера з рН 7,2 (20,6 г/л);

Суміш фіколл - візотраст: 9 г фіколу, 20 мл ізотрасту, 100 мл бідистильованої Н 2 0, щільність 1,077;

Субстрат для β-глюкуронідази: 31,5 мг паранітрофеніл-β-глюкуроніду та 100 мкм тритон X 100 розчиняють у 100 мл 0,05 М натрій-ацетатного буфера з рН 5;

Реагенти для визначення дефіциту мієлопероксидази: фіксатор (10 мл 37% формальдегіду з 90 мл абсолютного етанолу), субстратний розчин (100 мл 30% ЕДТА, 0,3 г хлористого бензидину, 0,038 г ZnS0 4 x7H 2 0, 0 г CH 3 C00Nax3H 2 0, 0,7 мл 3% Н 2 0 2); підводять рН 1,0 М NaOH до 6,0.

Комерційні реагенти:

ФСБ, розчин Хенкса та середовище Голка-MEM (Держ. інститут імунних препаратів та поживних середовищ, Берлін-Вайсензеї, НДР);

Гепарин (5000 ОД/мг) (Gedeon Richter, Угорщина);

Сироватка ембріонів корів (Flow Laboratories, США, можна іншої фірми);

Візотраст (VEB Fahlberg List, Magdeburg, НДР);

Інфуколл (VEB Serumwerk Bernburg, НДР);

Декстран, Фікол (Pharmacia, Швеція);

Колоїдне вугілля Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, ФРН);

Діізодецилфталат, парадіоксан (Coleman, Matheson and Bell, США);

Тритон X 100 (Serva, ФРН, можна іншої фірми);

Олійний червоний О (Allied chemical corp., Morristown, NY, США);

Іаранітрофеніл-β-глюкуронід (Sigma, США);

Сафранін О (Fischer Scientific Lab., Chicago, США);

Полістиролові намисто, трубочки (Nunc, Данія);

Сітка F 905 (VEB Orvo Wolfen, НДР).

Одержання фагоцитів

Необхідні відомості про виділення гранулоцитів людини можна отримати у розділі "Розподіл клітин імунної системи"; отримання перитонеальних макрофагів див. у розділах "Культивування макрофагів і моноцитів" та "Виділення макрофагів із суспензії сплеїоцитів". Детально це питання розглядається у низці робіт.

Крім того, слід ще згадати про наступні методи:

8 мл крові змішують із розчином декстранглюкози. Потім додають 6% розчин декстрану 75 0,15 М NaCl (5 мл). Суміш залишають на 45-50 хв за кімнатної температури для седиментації еритроцитів. Відсмоктують плазму. Залишкові еритроцити лізують додаванням 0,83% хлористого амонію (35 мл до 15 мл плазми). Центрифугують 10 хвилин при 80g, осад суспендують в охолодженому до 0°С 0,15 М NaCl. Об'єднують кілька опадів та центрифугують 10 хвилин при 800 g. Клітини краще зберігати на льоду в 0,15 М NaCl (це середовище більше підходить, ніж забуферені середовища з бівалентними катіонами, що спричиняють злипання клітин);

Якщо об'єктом фагоцитозу є дріжджі, можна опустити стадію обробки хлористим амонієм, оскільки еритроцити не заважають процесу. Мононуклеари можна отримувати наступним чином: гепаринізовану кров змішують з 1/3 об'єму середовища Голка, що містить 15% глюкози, нашаровують на шар суміші фікол - візотраст і центрифугують 20 хв при 400 g. Фракцію мононуклеарів відсмоктують пастерівською піпеткою, двічі відмивають ФСБ і готують суспензію на середовищі Голка (1х107 клітин/мл).

Приготування частинок для фагоцитозу

Найчастіше використовують живі культури Staphylococcus aureus (SG 511 або 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli та інші ентеробактерії, листерії, коринебактерії, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Мікроорганізми вирощують 24 години (при необхідності 48 год) на твердих та рідких живильних середовищах. Зібрану біомасу тричі відмивають 0,15 М NaCl. Занадто густу завись вимірюють при 640 нм, визначають концентрацію по калібрувальної кривої.

Концентрацію мікроорганізмів визначають також методами розсіву на щільні живильні середовища; у деяких випадках підрахунок мікроорганізмів можна проводити у лічильних камерах.

При роботі з живими бактеріальними культурами слід звертати увагу на те, щоб завжди використовувалися культури на одній і тій же стадії. Додавання 0,01% бичачий сироватковий альбумін сприяє виживаності мікроорганізмів. Виготовлена ​​суспензія залишається стабільною протягом 1-2 год.

Вбиті культури мікроорганізмів зазвичай отримують нагріванням протягом 30 хвилин при 80 ° С або обробкою парою. Вбиті мікроби тричі відмивають 0,15 М NaCl, ресуспендують та визначають концентрацію суспензії.

Приготування пекарських дріжджів: 0,5 г пекарських дріжджів суспендують 0,15 М NaCl і поміщають на 30 хв в киплячу водяну баню. Фільтрують через ватно-марлевий фільтр. При використанні живих дріжджів свіжі клітини (4-5-денна культура) тричі відмивають серед голки з додаванням 1,0% глюкози. Зазвичай використовують суспензію клітин 108 і 109 клітин/мл. Дріжджі використовують як тест-частин при виявленні дефектів компонента С5.

Використання суспензії частинок полістиролу: готують 10% водну суспензію частинок полістиролу діаметром 1,091 мкм. Розводять її у співвідношенні 1 + 1 0,2% розчином БСА 0,15 М NaCl, центрифугують. При довжині хвилі 253 нм суспензія полістиролу 1 мкг/мл дає поглинання 1,17 х10-3.

Застосування суспензії ліпополісахарид - олійний червоний Про в мінеральній олії: 2 г олійного червоного розтирають в 50 мл діізодецилфталату (або вазелінове масло) у фарфоровій ступці. Центрифугують 20 хв при 500 g. Додають 10 мкг надосадової фракції до 10 мл діоксину, вимірюють оптичну густину на довжині хвилі 525 ім. Чинник перерахунку дорівнює 0,92. На другому етапі 40 мг ліпополісахарид (Е. coli 0,26 В6 та ін) розчиняють у 3 мл 0,15 М NaCl. Потім додають до цієї суміші 1 мл олійного розчину червоного Про в диизодецилсульфате, суспендують суміш протягом 90 секунд. Суспензію використовують негайно, її можна заморожувати.

Для постановки реакції фагоцитозу як тестчастин можна використовувати формалінізовані еритроцити.

Фагоцитоз бактерій, бактерицидність

Експеримент із суспензією живих бактерій: зазвичай використовують співвідношення 3-10 мікробів/фагоцит. У загальному обсязі 2 мл змішують 1x10 6 фагацитів з 3х106 - 1х107 мікробів. Насправді до 1 мл суспензії фагоцитів, якого було додано 8 ME гепарину, доливають 1 мл суспензії бактерій. Час взаємодії становить зазвичай 30 хв, у деяких випадках він більший. Після інкубації відбирають 0,5 мл суміші, додають 1,5 мл 0,1% розчину желатину в розчині Хенкса, охолодженого до 0°З центрифугують 3-4 хв при 300 g. З осаду готують мазки, які забарвлюють за Паппенгеймом. Переглядають 200 клітин (по можливості тричі). Обчислюють відсоток фагоцитозу. За кількістю бактерій, що містяться в клітинах, розраховують індекс активності фагоцитозу: число фагоцитованих бактерій множать на відсоток фагоцитуючих клітин; Інтенсивність фагоцитозу виражають числами від 1 до 4.

Ступінь 1: фагоцитовано I-4 бактерії
Ступінь 2: фагоцитовано 5-7 бактерій
Ступінь 3: фагоцитовано 8-10 бактерій
Ступінь 4: фагоцитовано понад 10 бактерій на клітину

При визначенні рівня фагоцитозу живих мікробів окремо перевіряють осад клітин та надосадову фракцію. Кількість живих мікробів визначають розсівання на щільні живильні середовища 0,1 мл досліджуваних фракцій. Інкубують 24 (48) год. При розрахунку бактерицидності виходять з того, що одна колонія, що утворилася, відповідає одному живому мікробу.

Для спрямованого вивчення бактерицидності досліджують кров пацієнтів та здорових донорів з додаванням розчину антибіотиків (по 5000 ОД пеніциліну та стрептоміцину/мл) та без нього, а також проводять бактеріальний контроль. Склад проби: 0,3 мл розчину Хенкса+ 0,1 мл нормальної сироватки, одержаної з крові, взятої у 5 донорів, +0,5 мл суспензії лейкоцитів (10 7 клітин/мл) +0,1 мл суспензії мікробів (10 6 мікробів/мл). Розчин антибіотиків вносять по 0,02 мл пробу. Інкубують проби при 37 °С і визначають кількість мікробів через 20 хвилин, 1,5 години та 3 години. Для цього відбирають по 0,1 мл з кожної проби, розводять відібрані аліквоти розчином Хенкса в 10, 100 та 1000 разів і наносять на підігрітий агар. Іноді, особливо якщо були додані антибіотики, для точного підрахунку мікробів готують проміжні розведення (наприклад, 0,2 мл проби змішують з 5 мл розчину Хенкса, центрифугують 5 хвилин при 450 g, розчиняють осад в 1,9 мл ФСБ, наносять на агар) . Якщо хочуть скоротити тривалість бактеріологічного дослідження, можна визначати мікроби, що знаходяться всередині клітини, за флюоресценцією за допомогою фарбування акридиновим жовтим.

Фагоцитоз пекарських дріжджів: готують суспензію 10 9 клітин/мл 0,15 М NaCl. Змішують 0,1 мл суспензії з 0,1 мл плазми хворого, інкубують 30 хв при 37 °С, додають 0,2 мл (10 6) ПМЯЛ, інкубують 30 хв. Відбирають аліквоти через інтервали від 5 до 30 хв. Прораховують 100 ПМЯЛ і визначають кількість захоплених дріжджових частинок на клітину. Відома наступна модифікація: до 50 мкл сироватки морської свинки додають 50 мкл досліджуваної сироватки (попередньо її розводять у співвідношенні 1 + 1 середовищем Голка з глюкозою), додають 50-200 мкл суспензії лейкоцитів (10 7 Голка з глюкозою та інкубують 30 хв при 37 °С. Потім додають 50 мкл суспензії дріжджів (10 8 клітин/мл) перемішують інкубують 40 хвилин при 37 °С. Вносять 50 мкл L-75 Sе-метіоніну (загальна активність 100 кБк) перемішують та інкубують 1 годину при 37 °С. Осідають клітини центрифугуванням протягом 5 хвилин при 1000 g, відмивають їх двічі ФСБ, вимірюють радіоактивність на гамі-лічильнику. Відсоток фагоцитованих дріжджів обчислюють за такою формулою:

Фагоцитоз з використанням олійного розчину червоного в мінеральній олії: 0,2 мл суспензії частинок змішують з 0,8 мл клітинної суспензії, попередньо нагрітої до 37°С. Через 5 хвилин інкубації додають 6 мл охолодженого до 0°З 0,15 М розчину NaCl, що містить 126 мкг/кл N-етилмалеіміду (для припинення захоплення частинок). Центрифугують 10 хвилин при 250 g. Надосадову фракцію відкидають, осад ресуспендують у розчині NaCl і N-етилмалеіміду (див. вище), двічі відмивають клітини. Лізують клітини ультразвуком, відбувається вивільнення олійного червоного. Додають 1 мл діоксану. Центрифугують 15 хвилин при 500 g, вимірюють оптичну щільність хвилі 525 нм проти чистого діоксану. Ступінь фагоцитозу (ІФ) визначають як кількість мінеральної олії (мг), що поглинається за хвилину 10 7 клітинами. Для підрахунку можна використати таку формулу:

Дослідження фагоцитозу в моношарі макрофагів:

1. Фаза: в стерильні полістирольні пробірки вносять по 2 мл суспензії клітин (200 000 клітин/мл). Інокулюють 5 годин при 37°З потім відмивають середовищем Голка. Вносять у пробірки 2 мл культурального середовища з 10% інактивованої (30 хв, 56 °С) сироватки ембріонів корів, інкубують при 37 °С.

2. Фаза А: вносять суспензію мікробів (3-10/макрофаг), інкубують 30-60 хв при 37 °С, 6 разів обполіскують пробірки порціями середовища по 3 мл для видалення нефагоцитованих мікробів. Негайно фіксують препарат сумішшю 1 частини крижаної оцтової кислоти з 3 частин метанолу. Фарбують препарат по May - Griinwald, підраховують клітини.

Фаза Б: Визначення внутрішньоклітинних живих бактерій. Послідовність операцій та ж, що у фазі А до етапу фіксації. Після відмивання ретельно видаляють усі сліди середовища. Лізують клітини, для чого вносять 2 мл 0,01% стерильного розчину бичачий сироватковий альбумін (4°С), багаторазово струшують. Більшість клітин лізується через 20 хвилин. Вивільнені бактерії визначають шляхом розсіву на щільні живильні середовища.

Фагоцитоз еритроцитів: змішують 4x10 7 фагоцитів з 5x10 7 тест-еритроцитів у 5 мл ФСБ. Переносять 2 мл суміші охолоджений до 0°С 5 мМ фосфатний буфер і центрифугують. Вимірюють оптичну густину надосадової фракції при довжині хвилі 420 нм. Ступінь фагоцитозу визначають за зниженням вмісту гемоглобіну в безклітинній фазі за допомогою калібрувальних кривих.

Спрощений метод визначення кліренсу

Приклад визначення кліренсу на щурах: тваринам вводять внутрішньочеревно по 5х10 7 мікробів на 100 г ваги (0,1 мл / / 100 г). Оптимальна доза може коливатися від 106 до 108 на 100 г ваги. З інтервалом 1-2 години з кожної групи експериментальних тварин забивають по 3 особи; загальна тривалість експерименту 16 год. Стерильно беруть 0,5 мл крові із серця, 1 мл перитонеальної рідини, виділяють легені, печінку, селезінку та нирки. З тканини органів вирізають циліндри пастерівською піпеткою. Визначають кількість мікроорганізмів шляхом культивування на рідких та твердих живильних середовищах.

Приклад визначення кліренсу на мишах: використовують колоїдне вугілля або мічені 51 [Сг] еритроцити барана. Мишам (щонайменше 5 особин на досвід) внутрішньовенно вводять по 0,01 мл суспензії вугілля з розрахунку 16 мг на 100 г ваги. Протягом 15 хвилин з інтервалом 2 хвилини відбирають по 0,025 мл крові з ретроорбітального простору. Відібрані 0,025 мл крові вносять у 2,0 мл 0,1% розчину Na 2 C0 3 . Після гемолізу концентрацію вугілля визначають колориметрично на довжині хвилі 675 нм за допомогою кривих калібрувань.

t-час у хвилинах, С – концентрація вуглецю в пробі.

Кориговане значення фагоцитозу:

Функціональний скринінг фагоцитів

Визначення дегрануляції (вимірювання активності (β-глюкуропідази): 10 7 лейкоцитів суспендують в 0,8 мл ФСБ у пластикових пробірках, струшують 5 хвилин при 37 ° С. Додають 0,2 мл сенсибілізованих ЛПС, флюорохромнрованих0 хв на льоду, центрифугують 10 хвилин при 250 g. Перевіряють активність ферменту в надосадовій фракції і додають 2 мл 0,1 М NaOH, вимірюють оптичну щільність на хвилі. 410 нм.

Розрахунок:

(ОП 410 х20)/(1,84х18) = число нмолей речовини, що вивільняються за 1 годину 10 7 лейкоцитами, тобто ступінь дегрануляції виражають в наномолях паранітрофеніл-β-глюкуроніду.

Метод визначення дефектів мієлопероксидази: найкращі результати дає біохімічне визначення Н202, що вказує на зміни метаболізму в процесі фагоцитозу. Для практичних цілей дуже важливо, що активація гексозо-монофосфатного шунту, відновлення тетразолієвого нітроєнного та зв'язування екзогенного йоду з білками ПМЯЛ корелюють з утворенням Н202. Звичайний мазок крові фіксують 30 секунд сумішшю алкоголь-формалін. Відмивають дистильованою водою і протягом 30 сек проводять забарвлення на пероксидазу. У клітинах, що містять пероксидазу, виявляються включення, пофарбовані в темно-блакитний колір.

Проба відновлення тетразолиевого нітросинього (ТНС). ТНС відновлюється нормальними ПМЯЛ до формазану. Змішують з 0,1 мл крові 0,1 мл 0,1% розчину ТНС 0,15 М NaCl, інкубують 20 хвилин при 37 °С, ще раз ретельно перемішують. Включення формазану до клітин визначають мікроскопією. Результат виражають у відсотках формазан-позитивних клітин.

Дещо складніший наступний метод: 1 краплю крові пацієнта наносять на покривне скло. Інкубують 20 хвилин при 37°С у вологій камері, потім обережно відмивають скло стерильним 0,15 М NaCl. Кладають покривне скло на предметне, куди було нанесено 1 крапля ТНС-середовища (0,5 мл сироватки + 0,3 мл стерильного 0,15 М NaCl + 0,6 мл ТНС, див. раніше). Інкубують 30 хвилин у вологій камері при 37 С, видаляють покривне скло і висушують на повітрі. Протягом 60 секунд фіксують абсолютним метанолом та відмивають дистильованою водою. Фарбують протягом 5 хв сафраніном (1 г сафраніну + 100 мл дистильованої води + 40 мл гліцерину), відмивають. Формазан-позитивні клітини відрізняються великими розмірами, вони нагадують бластні клітини та містять блакитні гранули. Зазвичай у препараті визначається близько 30% формазан-позитивних клітин.

Наведені вище методи оцінки фагоцитозу є узагальнення дуже великої кількості публікацій. Детальнішу інформацію з цих питань можна знайти у відповідних роботах.