Isasaalang-alang ng artikulong ito ang mga pamamaraan para sa pagtukoy ng mga amino acid, na ginagamit hindi lamang sa pagsusuri ng mga produkto, ngunit sa biochemistry at pharmaceutical analysis.

Ang kabuuang halaga ng mga amino acid ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng isang photometric na pamamaraan batay sa pagpapasiya ng ammonia na nakuha mula sa mga amino acid ayon sa pamamaraang Kjeldahl.

Reaksyon sa 1-naphthol. Upang matukoy ang arginine, histidine, tyrosine, isang reaksyon na may 1-naphthol ay iminungkahi. Sa pagkakaroon ng sodium hypochlorite (NaOCl), ang solusyon ay nagiging pula. Ang isang sample na solusyon sa 50% ethanol na naglalaman ng amino acid ay pinalamig ng yelo at isang 10% NaOCl solution at isang naphthol solution ay idinagdag. Ang produkto ng reaksyon ay may kulay na pula (l max = 550 nm). Ang nilalaman ng mga amino acid ay tinutukoy ng intensity ng kulay ng nagresultang solusyon.

Biuret reaction. Ang isa sa pinakamahalagang reaksyon na ginagamit upang matukoy ang mga amino acid ay ang reaksyon ng biuret. Ang reaksyon ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagdaragdag ng isang dilute aqueous solution ng tanso (II) na asin sa isang alkaline na solusyon ng biuret. Sa kasong ito, ang solusyon ay nagiging isang matinding kulay ng violet dahil sa pagbuo ng isang kumplikadong tambalan.

Ang mga compound na naglalaman ng hindi bababa sa 2 amide group o isang aminohydroxyethylene group, pati na rin ang amides at imides ng amino acids ay pumapasok sa biuret reaction. Ang mga protina at puro solusyon ng mga amino acid at amide ay nagbibigay ng reaksyong ito. Ang mga dilute na solusyon ng mga amino acid ay hindi nagbibigay ng reaksyong biuret at samakatuwid ang reaksyon ay maaaring gamitin upang maitaguyod ang pagtatapos ng hydrolysis ng protina. Ginagamit din ang reaksyon para sa qualitative at quantitative determination ng protina. Ang mga pamamaraan na ginagamit sa mga klinikal na diagnostic na laboratoryo para sa pagtukoy ng protina sa dugo at iba pang biological fluid ay batay sa reaksyon ng biuret.

reaksyon ng ninhydrin. Ang pangalawang pinakamahalagang reaksyon na ginamit upang matukoy ang mga amino acid ay ang reaksyon ng ninhydrin - isang reaksyon ng kulay para sa mga a-amino acid, na isinasagawa sa pamamagitan ng pag-init ng huli sa isang alkaline na solusyon ng labis na ninhydrin.

Ang Ninhydrin ay nagdadala ng oxidative decarboxylation ng mga a-amino acid na may pagbuo ng ammonia, carbon dioxide at isang aldehyde na naglalaman ng isang carbon atom na mas mababa kaysa sa orihinal na amino acid. Ang nabawasang ninhydrin pagkatapos ay tumutugon sa inilabas na ammonia at ang pangalawang molekula ng ninhydrin, na bumubuo ng isang kulay na produkto ng condensation na may ammonia.

Ang resultang tambalan (pigment) ay may kulay violet-blue (l max = 570 nm). Ang pagbuo ng may kulay na tambalang ito ay ginagamit sa isang quantitative test para sa a-amino acids, kung saan ang mga amino acid ay maaaring makita, kahit na ang kanilang halaga ay hindi lalampas sa 1 μg.

Ang proline at hydroxyproline, na walang grupong a-amino, ay tumutugon sa ninhydrin upang bumuo ng mga dilaw na derivatives (l max = 440 nm). Ang reaksyon ay hindi tiyak, dahil ang isang may kulay na produkto na may ninhydrin ay nagbibigay din ng ammonia at mga compound na naglalaman ng isang amino group (amines, proteins, peptides). Gayunpaman, walang CO 2 na inilabas kasama ng mga compound na ito. Ang paglabas ng carbon dioxide ay katangian lamang para sa mga a-amino acid. Ang reaksyon ay ginagamit para sa colorimetric quantitative determination ng a-amino acids, kabilang ang sa awtomatikong amino acid analyzers (pagsukat ng CO 2 volume).

Ang reaksyon ng ninhydrin ay ginagamit upang matukoy ang glycine, isoleucine, leucine; ang hindi gaanong matinding kulay ay ibinibigay ng serine, phenylalanine, cysteine, tyrosine, tryptophan, atbp.

Ang mga resultang produkto ay nailalarawan sa pamamagitan ng medyo matinding kulay (e = 1.8–3.3 10 4), ngunit ang mga produktong may kulay ay hindi matatag. Mabilis na bumababa ang intensity ng kulay. Ang CdCl 2 ay idinagdag para sa pagpapapanatag. Ito ay bumubuo ng mga matatag na complex na may mga resultang compound. Pinapabilis din ng cadmium chloride ang reaksyon.

Ang mga amino acid at ilang iba pang compound na naglalaman ng isang amino group ay nag-condense sa isang alkaline na medium na may 1,2-naphthoquinone - 4-sulfoxylate upang bumuo ng pula, dilaw, orange-colored derivatives ng 1,2-naphthoquinone monoimine.

Ang reaksyon ay ginagamit upang matukoy ang a-amino acids (valine, isoleucine, leucine, atbp.).

Ang reaksyon na may 4-dimethylaminobenzaldehyde ay maaaring gamitin upang matukoy ang tryptophan. Ang produkto ng reaksyon ay may kulay na lila at ang intensity ng kulay ay tumutukoy sa nilalaman ng tryptophan sa nasuri na solusyon.

Gayunpaman, dapat tandaan na ang reaksyong ito ay bihirang ginagamit sa pagsusuri ng pagkain.

Para sa dami ng pagpapasiya ng mga amino acid na naglalaman ng asupre, ginagamit ang isang paraan ng bromatometric, batay sa sumusunod na reaksyon:

Ang isang solusyon ng cysteine ​​​​sa 1% na solusyon ng NaOH ay ibinuhos sa isang prasko na may ground stopper, 0.1 N. potassium bromate solution, dry potassium bromide at acidified na may 10% HCl.

BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O

Ang bromine ay nabuo bilang isang resulta ng reaksyon, ang halaga nito ay katumbas ng dami ng potassium bromate, ay tumutugon sa amino acid. Pagkatapos ng 10 minuto, idinagdag ang potassium iodide, na tumutugon sa hindi na-react na bromine, at ang inilabas na yodo ay na-titrate ng 0.1 N. sodium thiosulfate solution na may starch bilang indicator.

2I - + Br 2 → Br - + I 2

Ang halaga ng thiosulfate na ginamit para sa titration ay katumbas ng dami ng bromine na hindi tumutugon sa amino acid. Sa pamamagitan ng pagkakaiba sa pagitan ng dami ng idinagdag na potassium bromate at thiosulfate, ang dami ng bromine na tumutugon sa amino acid ay matatagpuan, at samakatuwid ang dami ng amino acid.

Ang methionine ay tinutukoy nang katulad. Ang methionine ay na-oxidized sa sulfone:

Ang reaksyong ito, sa ilalim ng ilang mga kundisyon, ay nagbibigay-daan sa iyo upang tumpak na matukoy ang nilalaman ng methionine.



Ang mga amino acid ay maaaring matukoy gamit ang mga reaksyon ng kulay: ninhydrin, xantoprotein, Fol, Milon, mga pagsusuri sa biuret, atbp. Ang mga reaksyong ito ay hindi tiyak, dahil ay batay sa pagtuklas ng mga indibidwal na fragment sa istraktura ng mga amino acid, na maaari ding mangyari sa iba pang mga compound.

Reaksyon ng Ninhydrin, isang reaksyon ng kulay na ginagamit para sa qualitative at quantitative determination ng amino acids, imino acids at amines. Kapag pinainit sa alkaline na daluyan ng ninhydrin (triketohydrindenhydrate, C 9 H b O 4) na may mga sangkap na may pangunahing mga grupo ng amino (-NH 2), nabuo ang isang produkto na may matatag na matinding asul-violet na kulay na may maximum na pagsipsip na humigit-kumulang 570 nm. Dahil ang pagsipsip sa wavelength na ito ay depende sa linearly sa bilang ng mga libreng grupo ng amino, ang reaksyon ng ninhydrin ay nagsilbing batayan para sa kanilang quantitative determination sa pamamagitan ng colorimetry o spectrophotometry. Ginagamit din ang reaksyong ito upang matukoy ang pangalawang grupo ng amino (> NH) sa mga imino acid - proline at hydroxyproline; sa kasong ito, nabuo ang isang maliwanag na dilaw na produkto. Sensitivity - hanggang sa 0.01%. Ang modernong awtomatikong pagsusuri ng amino acid ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng paghihiwalay ng ion-exchange ng mga amino acid at ang kanilang dami ng pagpapasiya gamit ang reaksyon ng ninhydrin. Kapag pinaghihiwalay ang mga pinaghalong amino acid sa pamamagitan ng paper chromatography, ang bawat amino acid ay maaaring matukoy sa halagang hindi bababa sa 2-5 µg.

Ang dami ng mga amino acid ay maaaring hatulan ng intensity ng kulay.

Ang reaksyon na ito ay positibo hindi lamang sa mga libreng amino acid, kundi pati na rin sa mga peptide, protina, atbp.

reaksyon ng xantoprotein ay nagbibigay-daan sa iyo upang makita ang mga aromatic amino acids (phenylalanine, tyrosine, histidine, tryptophan), batay sa reaksyon ng electrophilic substitution sa aromatic nucleus (nitration).

Sa ilalim ng pagkilos ng puro nitric acid, halimbawa, sa tyrosine, nabuo ang isang dilaw na produkto.

reaksyon ni Fohl. Ito ay isang reaksyon sa cysteine ​​​​at cystine. Sa panahon ng alkaline hydrolysis, ang "weakly bound sulfur" sa cysteine ​​​​at cystine ay madaling nahati, na nagreresulta sa pagbuo ng hydrogen sulfide, na, na tumutugon sa alkali, ay nagbibigay ng sodium o potassium sulfides. Kapag ang lead(II) acetate ay idinagdag, ang isang gray-black precipitate ng lead(II) sulfide ay nabuo.

Paglalarawan ng karanasan. Ibuhos ang 1 ml ng cystine solution sa isang test tube, magdagdag ng 0.5 ml ng 20% ​​sodium hydroxide solution. Ang timpla ay pinainit hanggang sa kumukulo, at pagkatapos ay idinagdag ang 0.5 ml ng lead(II) acetate solution. Ang isang gray-black precipitate ng lead(II) sulfide ay sinusunod:

reaksyon ni Zimmermann. Ito ay isang reaksyon sa amino acid glycine.

Paglalarawan ng karanasan. Sa 2 ml ng isang 0.1% na solusyon ng glycine, na nababagay sa pamamagitan ng pagdaragdag ng 10% na solusyon ng alkali sa pH = 8, ibuhos ang 0.5 ml ng isang may tubig na solusyon ng o-phthalic dialdehyde. Ang pinaghalong reaksyon ay nagsisimula nang dahan-dahang maging maliwanag na berde. Pagkatapos ng ilang minuto, lumilitaw ang isang berdeng precipitate.

tugon sa tryptophan. Ang tryptophan, na tumutugon sa isang acidic na kapaligiran na may mga aldehydes, ay bumubuo ng mga kulay na produkto ng condensation. Halimbawa, sa glyoxylic acid (na isang impurity sa concentrated acetic acid), ang reaksyon ay nagpapatuloy ayon sa equation:

Ang reaksyon ng tryptophan na may formaldehyde ay nagpapatuloy ayon sa isang katulad na pamamaraan.

reaksyon ni Sakaguchi. Ang reaksyong ito sa amino acid arginine ay batay sa pakikipag-ugnayan ng arginine sa α-naphthol sa pagkakaroon ng isang oxidizing agent. Ang mekanismo nito ay hindi pa ganap na naipaliwanag. Tila, ang reaksyon ay isinasagawa ayon sa sumusunod na equation:

Dahil ang mga derivatives ng quinoneimines (sa kasong ito, naphthoquinone), kung saan ang hydrogen ng imino group –NH– ay pinalitan ng isang alkyl o aryl radical, ay palaging may kulay sa dilaw-pulang tono, kung gayon, tila, ang orange-red. Ang kulay ng solusyon sa panahon ng reaksyon ng Sakaguchi ay dahil sa hitsura ng tiyak na derivative na naphthoquinoneimine. Gayunpaman, ang posibilidad ng pagbuo ng isang mas kumplikadong tambalan dahil sa karagdagang oksihenasyon ng natitirang mga pangkat ng NH ng arginine residue at ang benzene ring ng α-naphthol ay hindi ibinukod:

Paglalarawan ng karanasan. Ibuhos ang 2 ml ng 0.01% na solusyon ng arginine sa isang test tube, pagkatapos ay magdagdag ng 2 ml ng 10% na solusyon ng sodium hydroxide at ilang patak ng 0.2% na solusyon sa alkohol ng α-naphthol. Ang mga nilalaman ng tubo ay halo-halong mabuti, 0.5 ML ng hypobromite solution ay idinagdag at halo-halong muli. Ang 1 ml ng isang 40% na solusyon sa urea ay idinagdag kaagad upang patatagin ang mabilis na pagbuo ng kulay kahel-pula.

Biuret reaction- ginagamit bilang isang reaksyon ng kulay para sa mga protina. Sa isang alkalina na kapaligiran sa pagkakaroon ng tanso(II) na mga asing-gamot, nagbibigay sila ng isang kulay-lila. Ang kulay ay dahil sa pagbuo ng isang copper(II) complex compound, dahil sa peptide group -CO-NH- na katangian ng mga protina. Ang reaksyong ito ay nakuha ang pangalan nito mula sa derivative ng urea - biuret, na nabuo sa pamamagitan ng pagpainit ng urea na may pag-aalis ng ammonia:

Bilang karagdagan sa mga protina at biuret, ang iba pang mga compound na naglalaman ng pangkat na ito ay nagbibigay din ng parehong paglamlam: amides, imides ng mga carboxylic acid, pati na rin ang mga compound na naglalaman ng mga grupo -CS-NH- o \u003d CH-NH- sa molekula. Ang mga protina, ilang amino acid, peptides, biuret at medium peptone ay nagbibigay din ng reaksyon.

Ang kulay ng complex na nakuha ng biuret reaction na may iba't ibang peptides ay medyo naiiba at depende sa haba ng peptide chain. Ang mga peptide na may haba ng kadena ng apat na residue ng amino acid at pataas ay bumubuo ng isang pulang complex, tripeptides - purple, at dipeptides - asul.

ketone form ng isang polypeptide

enol na anyo ng isang polypeptide

Kapag ang polypeptide ay nakikipag-ugnayan sa Cu (OH) 2, isang complex ang nabuo, ang istraktura nito ay maaaring ipakita bilang mga sumusunod.

At mga protina

Ito ay kilala na ang lahat ng 20 varieties ng canonical α-amino acids ay may parehong istraktura, na may tatlong mga variant ng functional group (Fig. 3.3). Sa kasamaang palad, ang mga reaksyon sa amino at carboxy group ay hindi masyadong tiyak, dahil ayon sa pagkakabanggit, katangian ng lahat ng mga amine, isang bilang ng mga amide at carboxylic acid. Ang parehong naaangkop sa karamihan ng kanilang mga radicals = R, 10 sa mga ito ay non-polar, iyon ay, kinakatawan sila ng aliphatic = hydrocarbon group, karamihan sa mga ito ay chemically inert. Ang pagtitiyak ng karamihan sa mga R polar amino acid ay medyo mababa din, kung saan nangyayari ang alkohol (Ser, Tre, Tyr) amide (Acn, Gln) at mga pangkat ng carboxyl (Asp, Glu). Ang amino group (Liz), imidazole His, at ang guanidino group na Arg ay mas aktibo, habang ang aktibidad ng thio group na Cys ay ang pinakamataas. Samakatuwid, ang unibersal na reaksyon ng ninhydrin, na tiyak para sa sabay-sabay na presensya ng parehong amino at carboxy na mga grupo sa α-C atom, ay nakatanggap ng pinakamalaking praktikal na kahalagahan sa husay at dami ng pagsusuri ng mga α-amino acid, kabilang ang mga amino acid analyzers.

kanin. 3.3. Pangkalahatang mga formula para sa istruktura ng mga α-amino acid at ang kanilang polymerization product. Mga paliwanag sa teksto.

Ang polymerization ng α-amino acids sa istruktura ng mga peptides at protina (Fig. 3.3) ay nagpapanatili ng lahat ng uri ng kanilang R, ngunit:

1. Nagiging negatibo ang reaksyon ng ninhydrin, dahil maliban sa N- at C-terminal, ang α-amino at α-carboxy na mga grupo ay ginugugol sa pagbuo ng mga peptide bond. Ang positibong reaksyon ng ninhydrin na may protina sa halip ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng mga dumi ng amino acid sa paghahanda o mga pinggan.

2. Para sa lahat ng peptides at protina, ang reaksyon ng biuret sa peptide group, na wala sa monomeric amino acids, ay tiyak.

3. Sa mga mas tiyak na reaksyon sa R ​​amino acids, ang mga sumusunod ay kapaki-pakinabang: reaksyon ng xantoprotein na may puro nitric acid, sa mabangong R Phe, Tyr, Tri; ang reaksyon na may isatin para sa limang miyembro na singsing na Pro, pati na rin ang mga reaksyon para sa imidazole R His, ang thio group na Cys, at ang guanidino group na Arg. Mahalagang isaalang-alang na ang ilan sa mga R na ito ay nakatago sa loob ng mga globule ng protina, at samakatuwid, ang mga husay na reaksyon sa kanila ay humina. Samakatuwid, bago isagawa ang mga ito, ang mga protina ay karaniwang na-denatured sa isang paraan o iba pa.

4. Hindi tulad ng mga tunay na solusyon ng mga amino acid, ang mga colloidal na solusyon ng mga protina ay nailalarawan sa pamamagitan ng sedimentary reactions nauugnay sa pagkasira ng kanilang mga hydration shell at, bilang isang resulta, isang pagbaba sa kanilang solubility sa ilalim ng pagkilos ng mga ahente ng pag-alis ng tubig: neutral salts = salting out, methanol = MeOH, ethanol = EtOH, acetone, urea, at iba pang mga ahente.

Ang pagsasagawa ng mga husay na reaksyon, dapat mong:

1. Maingat na sundin ang mga alituntunin ng kaligtasan sa sunog at magtrabaho kasama ang puro acids at alkalis = EJ.

2. Markahan ang 2 hilera ng mga test tube na may glassgraph o felt-tip pen at maglagay ng hindi hihigit sa 0.5 ml (2-5 patak) ng 1% amino acid solution sa isa sa mga ito, at humigit-kumulang sa parehong dami ng 1% na solusyon sa protina sa kabilang.

3. Sa isang pares ng mga test tube na may mga solusyon sa amino acid at protina, magdagdag ng 3-5 patak ng kaukulang mga reagents nang magkatulad at isagawa ang natitirang mga pamamaraan na ipinahiwatig para sa kaukulang reaksyon.

4. Kung kinakailangang painitin ang mga test tube, tanggalin ang takip ng crucible at sunugin upang matuyo ang gasolina gamit ang posporo. Pagkatapos, i-clamp ang test tube sa lalagyan, ang primitive na disenyo nito ay napaka hindi mapagkakatiwalaan. Samakatuwid, mas mahusay na balutin ang isang pares ng mga test tube na may isang piraso ng papel na nakatiklop sa isang strip at, hawak ang mga ito gamit ang iyong hinlalaki, pantay na ipasa ang mas mababang kalahati ng mga test tube sa apoy, pag-iwas sa direksyon ng mga leeg sa mga kapitbahay at ang mabilis na pagkulo ng solusyon. Matapos makumpleto ang operasyon, napapanahong patayin ang apoy gamit ang takip ng crucible.

5. Ang mga resulta ng mga eksperimento, alinsunod sa template, ay gumuhit sa pagkalat ng isang laboratory notebook sa anyo ng isang talahanayan:

6. Matapos isaalang-alang ang mga resulta at, matapos makumpleto ang protocol, kasama ang isang rack ng mga test tube, ipakita ang mga ito sa guro para sa proteksyon.

1. Ninhydrin reaction. Batay sa deamination at decarboxylation ng α-amino acid na may solusyon sa alkohol ng ninhydrin:

Ang nagresultang ammonia, na tumutugon sa dalawang molekula ng ninhydrin, ay bumubuo ng isang derivative na may kulay na may maximum na pagsipsip sa 540 nm (para sa Pro - 440 nm).

Pag-unlad: Magdagdag ng 3-5 patak ng 0.5% alcohol solution ng ninhydrin sa mga sample na pinag-aaralan. Dahan-dahang init ang mga test tube na may mga mixtures sa apoy at pagkatapos ng 2-3 minuto irehistro ang hitsura ng kulay.

2. Xantoprotein reaksyon. Tulad ng nabanggit sa itaas, ito ay batay sa pagbuo ng mga nitro derivatives ng mga amino acid na may mabangong R: Phen, Tyr, Tri.

Pag-unlad: Pagbukas ng draft ng fume hood, maingat na magdagdag ng ilang patak ng concentrated nitric acid (HNO 3) sa isang pares ng mga test tube na may mga test solution. Dahan-dahang painitin ang mga test tube sa apoy, iwasan ang direksyon ng mga leeg sa mga kapitbahay, at irehistro ang pagbuo ng kulay.

3. Reaksyon ng Nitroprusside. Ito ay batay sa alkaline hydrolysis ng sulfur-containing amino acid cysteine, na may paglabas ng sodium sulfide (Na 2 S), na nagbibigay ng isang pulang complex na may bagong inihanda na solusyon ng sodium nitroprusside.

Pag-unlad: Magdagdag ng pantay na dami ng 20% ​​sodium hydroxide sa parehong mga tubo na may 5-10 patak ng mga solusyon sa pagsubok at pakuluan nang hindi bababa sa 3-5 minuto. Magdagdag ng 3-5 patak ng sodium nitroprusside solution sa mga test tube at itala ang pagbuo ng kulay.

4. Biuret reaction. Ito ay batay sa pagbuo sa isang alkaline na medium ng isang colored complex ng isang peptide bond na may Cu 2+ ion. Nagsisilbing unibersal na pagsubok para sa pagtuklas ng mga peptide at protina sa mga solusyon. Dahil sa pagtaas ng bilang ng mga peptide bond, ang intensity ng kulay ng solusyon ay tumataas nang linearly, malawak itong ginagamit para sa photometric na pagpapasiya ng mga konsentrasyon ng protina.

Pag-unlad. Idagdag ang parehong halaga ng 10% sodium hydroxide solution sa mga test tube na may 5-10 patak ng mga test solution. Haluing mabuti at magdagdag ng 2 patak ng 1% copper sulfate solution (CuSO 4). Paghaluin ang mga sample at pagkatapos ng ilang minuto irehistro ang pagbuo ng kulay.

5. Subukan sa pagpapakulo. Batay sa thermal denaturation ng mga protina.

Pag-unlad. Acidify ang parehong mga test tube na may mga test solution na hindi hihigit sa isang patak ng 1% acetic acid (AcOH) solution at init hanggang kumukulo. Pagkatapos kumukulo ang mga solusyon sa loob ng 2-3 minuto, irehistro ang mga resulta at ipaliwanag ang mekanismo ng hindi pangkaraniwang bagay.

6. Pag-ulan na may mga asin ng mabibigat na metal(Ako) . Ang kanilang mga katangian ng denaturing ay batay sa kakayahan ng mabibigat na Me cations na tumugon sa mga functional group na R ng molekula ng protina: thio-, amino-, carboxy-, aromatic. Gayundin, ang kanilang malalakas na anion ay nagdudulot ng muling pagkarga ng mga ionogenic na grupo sa mga molekula ng protina, at sa gayon ay sinisira ang mga ionic bond sa kanila.

Pag-unlad. Magdagdag ng ilang patak ng 5% na solusyon ng tansong sulpate (CuSO 4) sa parehong mga tubo ng pagsubok na may mga solusyon sa pagsubok. Itala at ipaliwanag ang mga resulta.

7. Pag-ulan na may mga organikong acid. Ito ay batay sa acid denaturation ng mga protina at ang pagbuo ng mga covalent derivatives ng thio-, amino- at aromatic group ng R amino acids na may mga organochlorine.

Pag-unlad. Magdagdag ng ilang patak ng 10% na solusyon ng trichloroacetic acid (TCA) sa mga test tube na may mga test solution at itala ang mga resulta sa loob ng ilang minuto

Kagamitan at reagent: chromatographic na papel; chromatographic na silid; photoelectric colorimeter; gunting; mga plato ng salamin (3x32 cm) - 3 mga PC.; may hawak para sa chromatograms; pagpapatayo ng cabinet; micropipettes; mga test tube na may ground stoppers; burette 25 ML; karaniwang pinaghalong mga amino acid; pagsubok na pinaghalong mga amino acid; butanol, acetic acid, tubig sa ratio na 15:3:7; 1% na solusyon ng ninhydrin sa 95% acetone; ethyl alcohol (75%), puspos ng tansong sulpate.

Pagkumpleto ng gawain

Kumuha ng isang sheet ng chromatographic paper na may sukat na 18x28 cm at gumuhit ng pahalang na linya gamit ang isang simpleng lapis sa layo na 3 cm mula sa maikling gilid nito. Pagkatapos ay nahahati ito sa hindi pantay na mga segment alinsunod sa nakalakip na pamamaraan at ang mga hangganan ng aplikasyon ng pamantayan at mga paghahalo ng pagsubok ay minarkahan ng mga arrow at ang kaukulang mga inskripsiyon ay ginawa gamit ang isang simpleng lapis.

Ang papel ay naayos sa itaas ng ibabaw ng talahanayan at sa panimulang linya, na limitado sa pamamagitan ng mga arrow, ang karaniwang timpla ay unang inilapat gamit ang isang espesyal na micropipette sa isang manipis na linya hanggang sa ang buong solusyon mula sa micropipette ay inilipat sa panimulang linya (ang micropipette ay napuno 2-3 cm). Ang masa ng inilapat na solusyon ay sinusukat sa pamamagitan ng pagtimbang ng pipette na puno ng karaniwang pinaghalong (bago ilapat ang solusyon) at walang laman (pagkatapos ilapat ang solusyon). Ang 0.02-0.03 g ng karaniwang solusyon ay karaniwang inilalapat sa papel. Pagkatapos ay punan ang isang malinis na pipette ng pinaghalong amino acid na susuriin (ibibigay ng guro para sa pag-aaral), timbangin ito at ilapat ang timpla sa panimulang linya na may naaangkop na marka.

Ang inihandang chromatogram ay inilalagay sa isang chromatographic chamber na may sistema ng mga solvents na dati nang ibinuhos dito upang paghiwalayin ang isang halo ng mga amino acid, halimbawa, isang halo ng butanol, acetic acid at tubig sa isang ratio na 15:3:7. Ang paghihiwalay ay isinasagawa sa pamamagitan ng pataas na chromatography hanggang ang front line ay umabot sa 2-3 cm sa tuktok na gilid ng chromatographic paper (finish line). Pagkatapos nito, ang chromatogram ay aalisin mula sa silid at ang itaas na dulo ng papel ay agad na ipinasok sa isang lalagyan na gawa sa tatlong glass rod na kinabit ng isang singsing na goma at inilagay sa isang fume hood sa loob ng 20 min upang alisin ang mga solvents mula sa papel.

kanin. 8. Scheme ng pag-aayos ng mga amino acid sa chromatogram:

A - punto ng paglalapat ng isang halo ng mga amino acid; I - cystine at cysteine;

2 - lysine; 3 - histidine; 4 - arginine; 5 - aspartic acid,

serye at glycine; 6 - glutamic acid at threonine; 7 - alanine;

8 - proline; 9 - tyrosine; 10 - valine at methionine; II - tryptophan;

12 - phenylalanine; 13 - leucine at isoleucine

Ang pinatuyong chromatogram ay inilubog sa isang 1% na solusyon ng ninhydrin sa acetone upang makita ang mga posisyon ng mga amino acid spot dito. Pagkatapos ang chromatogram ay inilalagay sa loob ng 10 min sa isang fume hood upang alisin ang acetone at inilipat sa isang oven, kung saan ito ay naiwan ng 15 min sa 70°C. Ang mga amino acid ng pamantayan at mga pinaghalong pagsubok ay nakita bilang mga asul-violet na spot na nakaayos sa isang chain sa direksyon ng solvent system mula sa panimulang linya hanggang sa itaas na gilid ng chromatogram.

Ang pagkakakilanlan ng mga amino acid na nakapaloob sa pinaghalong pagsubok ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagkakataon sa chromatogram ng mga posisyon na inookupahan ng mga amino acid ng pamantayan at mga pinaghalong pagsubok (Fig. 8).

Upang matukoy ang dami ng nilalaman ng mga amino acid sa mga pinaghalong pagsubok, ang chromatogram ay iginuhit gamit ang isang simpleng lapis upang ang mga may kulay na zone na nakahiga sa parehong antas, na tumutugma sa parehong amino acid, ay nakapaloob sa loob ng humigit-kumulang magkaparehong mga parihaba (Fig. 9) .

I II III IV

kanin. 9. Scheme ng pag-aayos ng mga amino acid sa chromatogram:

I - pinaghalong No. I; II - pinaghalong No. 2; 1U - pinaghalong No. 3; Ш - pamantayan

pinaghalong amino acid

Ang mga nakabalangkas na seksyon ng papel ay pinutol at inilagay sa mga test tube, ang mga numero nito ay dapat tumutugma sa mga bilang ng mga spot sa mga chromatogram. Ang 10 ml ng isang 75% na solusyon ng ethyl alcohol na puspos ng honey sulfate ay ibinuhos sa bawat test tube mula sa isang burette (0.2 ml ng isang puspos na solusyon ng tansong sulpate ay idinagdag sa 500 ml ng ethyl alcohol). Ang test tube ay sarado na may isang tapunan at, pana-panahong pagpapakilos, isang kumpletong paglipat ng brick-red na kulay (tanso na asin ng asul-violet ng Rueman) ay nakakamit mula sa papel patungo sa solusyon. Ito ay tumatagal ng 15-20 minuto. Ang absorbance (optical density) ng standard at test solutions ay sinusukat sa isang photoelectrocalorimeter na may green light filter (540 nm). Ang isang cuvette na may 75% na solusyon ng ethyl alcohol na may tansong sulpate ay naka-install sa reference stream.

Ang dami ng nilalaman ng mga amino acid sa solusyon sa pagsubok ay kinakalkula mula sa ratio ng mga pagkalipol ng pagsubok at karaniwang mga sample.

Halimbawa ng pagkalkula. Ipagpalagay na ang karaniwang pinaghalong naglalaman ng 1.8 mg ng glycine sa 1 ml, 0.02 g ng karaniwang solusyon na ito ay inilapat sa panimulang strip. Samakatuwid, ang chromatogram na natanggap (1.8×0.02) = 0.036 mg ng glycine. Sumang-ayon pa tayo na ang absorbance ng mga kulay na solusyon ay 0.288 para sa pamantayan at 0.336 para sa hindi kilalang timpla. Pagkatapos ang nilalaman ng glycine sa pinaghalong pagsubok na inilapat sa chromatogram ay magiging (36'0.336): 0.288=42 µg. Kung higit nating ipagpalagay na ang pinaghalong pagsubok ay inilapat sa chromatogram sa isang halaga ng, halimbawa, 0.0250 g, kung gayon ang nilalaman ng glycine sa 1 ml ng solusyon sa pagsubok ay magiging (42: 0.0250) = 1680 μg, o 1.68 mg / ml.

Gumuhit ng mga resulta ng iyong sariling eksperimento, gumawa ng mga konklusyon mula sa kanila.

Lab #15

Paghihiwalay ng ionFe 3+ , co 2+ , Ni 2+

Mga pamamaraan para sa pagtukoy ng mga amino acid

Ang mga amino acid ay biologically active substance, gumaganap sila ng mahalagang papel sa buhay ng katawan ng tao, malawak itong ginagamit bilang mga gamot. Ang ilan sa kanila ay kailangang-kailangan at pumasok sa katawan na may pagkain. Sa kasalukuyan, mayroong isang bilang ng mga pamamaraan para sa dami ng pagpapasiya ng mga amino acid sa mga materyales ng halamang gamot, sa mga gamot at biological fluid, at sa mga produktong pagkain.

Mula sa buong iba't ibang mga pamamaraan para sa dami ng pagpapasiya ng mga amino acid sa iba't ibang mga bagay, apat na pangunahing grupo ang maaaring makilala: chromatographic, spectrophotometric, titrimetric at electrochemical na pamamaraan ng pagsusuri.

Mga Paraan ng Chromatographic

Sa nakalipas na mga dekada, makabuluhang pagsulong ang nagawa sa larangan ng gas-liquid chromatography ng mga amino acid. Ang isang paraan gamit ang mga micropacked na column ay iminungkahi, na ginagawang posible upang paghiwalayin ang halos ganap na 17 biologically important α-amino acids sa medyo maikling panahon.

Ang isang paraan ay binuo para sa pagtukoy ng mga amino acid gamit ang gas-liquid chromatography sa mga sample ng serum, plasma, ihi at cerebrospinal fluid, batay sa paghahanda ng 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl-isobutyl ethers, na sinusundan ng paghihiwalay sa isang haligi ng polydimethylsiloxane sa temperatura programming mode mula 140°C. C hanggang 250°C na may flame ionization detector. Ang chromatographic separation time ay 28 minuto. Bilang resulta ng pananaliksik, posibleng paghiwalayin ang 27 amino acids.

Sa kabila ng iba't ibang mga pamamaraan ng mataas na pagganap na liquid chromatography sa pagsusuri ng mga amino acid, ang reversed-phase na bersyon na may spectrophotometric detection ay ang pinaka-nagpapahayag at naa-access. Para sa matagumpay na paghihiwalay at pagtuklas, ang mga amino acid ay na-convert sa hydrophobic at light-absorbing derivatives, iyon ay, ang pre-column derivatization ay isinasagawa. Bilang mga reagents para sa derivatization, ginagamit ang orthophthalaldehyde, naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde, 9-fluorenylmethylchloroformate.

Ang isang paraan para sa dami ng pagpapasiya ng L-cystine, L-glutamic acid at glycine sa Eltacin na gamot, na may aktibidad na antioxidant kasama ng isang antianginal na epekto, ay binuo. Ang glutamic acid at glycine ay tinutukoy ng reverse phase high performance liquid chromatography pagkatapos ng pre-column derivatization na may orthophthalaldehyde/N-acetyl-L-cysteine ​​​​reagent. Ang derivatization ng cysteine, ayon sa mga may-akda, ay mahirap dahil sa kawalang-tatag ng amino acid mismo at ang mga nagresultang derivatives. Samakatuwid, ang pagsusuri ng cysteine ​​​​ay isinagawa sa pamamagitan ng paraan ng bromatometric titration. Napag-alaman na ang pagkakaroon ng malaking halaga ng cysteine ​​​​sa sample ay hindi nakakasagabal sa pagpapasiya ng mga produkto ng derivatization ng glycine at glutamic acid na may orthophthalaldehyde / N-acetyl-L-cysteine ​​​​reagent. Ang pamamaraan ay nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na reproducibility at katumpakan ng pagpapasiya.

Ang posibilidad ng paggamit ng 4,7-phenanthroline-5,6-dione (fanquinone) bilang isang fluorogenic reagent-label para sa pre-column formation ng mga derivatives nito para sa paghihiwalay at quantitative analysis ng mga amino acid sa pamamagitan ng high-performance liquid chromatography ay naging pinag-aralan. Hindi nagtataglay ng sarili nitong pag-ilaw, ang phanquinone ay tumutugon sa mga grupong amino ng mga amino acid (sa 68 °C sa loob ng 160 min), na bumubuo ng mga iminoquinol, na ang fluorescence ay sinusukat sa haba ng daluyong na 460 nm. Ang mga nakahiwalay na derivatives ay kinilala ng Tm, IR, mass, at PMR spectra. Ang high-performance liquid chromatography ay isinagawa sa isang chromatograph na may fluorescent detector at isang column na may gradient elution na may mga mixtures: triethylamine solution - phosphate buffer (pH 3) - methanol. Ginamit ang Quinidine bilang isang panloob na pamantayan. Ang pamamaraang ito ay lubos na nangangako sa mga kondisyon ng malalaking laboratoryo at maaaring imungkahi para sa pagsusuri ng mga amino acid sa tapos na mga form ng dosis.

Isang pamamaraan para sa high-performance na liquid chromatography na may potentiometric biosensor para sa quantitative determination ng lysine ay binuo. Ang biosensor ay binuo sa pamamagitan ng paglakip ng isang lamad na naglalaman ng lysine oxidase sa isang ion-selective NH4+ electrode. Ang mga ammonium ions na nabuo sa panahon ng enzymatic degradation ng lysine ay nakitang potentiometrically. Ang isang chromatodenitometric express method para sa pagsusuri ng tryptophan sa mga kultural na likido ay binuo. Ang manipis na layer na chromatography ay isinagawa sa mga plato ng Sorbfil. Ang Chromatography ay isinasagawa sa system propanol-2 - 25% ammonium hydroxide solution (7:3) sa loob ng 25 minuto. Ang mga chromatogram ay pinatuyo sa temperatura ng silid at pinananatili sa 120 ° C sa loob ng 15 min. Upang makita ang mga spot sa chromatograms, ginamit ang isang tiyak na reagent - 4-dimethylaminobenzaldehyde, pumipili sa indole ring ng tryptophan, sa anyo ng isang 0.5% na solusyon sa ethanol na may pagdaragdag ng 5% na puro sulfuric acid. Matapos mabuo ang mga chromatogram sa pamamagitan ng paglulubog sa isang Teflon cuvette na may bagong inihandang solusyon ng 4-dimethylaminobenzaldehyde, pinananatili sila ng 5-7 minuto sa temperatura na 110°C. Ang mga tryptophan spot ay na-scan sa isang wavelength na 625 nm gamit ang isang computer video densitometer. Ang binuo na pamamaraan, sa kabila ng mataas na katumpakan ng pagpapasiya at pagiging produktibo, ay tiyak para sa tryptophan.

Para sa pagsusuri ng mga α-amino acid sa mga biological fluid, gamot, at mga produktong pagkain, ang mga pamamaraan ng capillary electrophoresis ay malawakang ginagamit, batay sa paghihiwalay ng mga bahagi ng isang kumplikadong halo sa isang quartz capillary sa ilalim ng pagkilos ng isang inilapat na electric field. Dahil ang mga amino acid ay zwitterionic sa kalikasan, maaari silang paghiwalayin gamit ang mga electrolyte buffer na may naaangkop na pH, ang pinakakaraniwang neutral at pangunahing mga separation buffer ay ginagamit.

Upang madagdagan ang pagtitiyak at pagiging sensitibo ng pamamaraan ng capillary electrophoresis para sa pagsusuri ng mga indibidwal na α-amino acid, ang kanilang paunang derivatization ay ginagamit, na sinusundan ng paghihiwalay sa isang quartz capillary at spectrophotometric na pagpapasiya ng mga produkto ng reaksyon. Kaya, ang 9-fluorenylmethyl formate, 9-(2-carbazole)-ethyl chloroformate, at cyanine dye ay ginagamit bilang mga derivatizing agent. Ang mga prospect ng pamamaraan ay dahil sa mga pakinabang nito tulad ng mabilis na pagsusuri, kadalian ng paghahanda ng sample, mababang pagkonsumo ng mga reagents, at kadalian ng instrumentation.