Determinado na Ang mga interferon ay na-synthesize sa cell, una sa anyo ng mga precursor na naglalaman ng isang signal peptide sa N-terminus ng polypeptide chain, na pagkatapos ay pinutol at, bilang isang resulta, isang mature interferon na may buong biological na aktibidad ay nabuo. Ang bakterya ay hindi naglalaman ng mga enzyme na may kakayahang magtanggal ng signal peptide upang bumuo ng isang mature na protina. Upang ang bakterya ay nag-synthesize ng mature interferon, tanging ang bahagi ng gene na nag-encode nito ang dapat ipasok sa plasmid, at ang bahagi ng gene na nag-encode ng signal peptide ay dapat alisin. Ang pamamaraan ay nangangailangan pagsunod sa mga sumusunod na kondisyon:

Ang interferon gene ay dapat maglaman ng tatlong Sau 3A1 cleavage site, kung saan ang isa ay katabi ng signaling portion.

Ang hindi kumpletong cleavage ng gene na may ganitong enzyme ay ginagawang posible na ihiwalay ang isang gene fragment na naglalaman ng nucleotide sequence na nag-encode ng mature na interferon.

Ang ATG triplet encoding cysteine ​​​​ay pinuputol ng enzyme kasama ang bahagi ng signal.

Upang maibalik ang pagkakasunud-sunod ng polynucleotide ng kumpletong gene, ang isang fragment ng DNA ay na-synthesize ng kemikal na naglalaman ng triplet na ito, pati na rin ang triplet ng ATG na katabi nito, ang punto ng pagsisimula ng synthesis ng protina.

Ang fragment na ito ay nakakabit sa nakahiwalay na bahagi ng mature na gene, na nagreresulta sa pagpapanumbalik ng kumpletong mature na interferon gene.

Ang reconstructed gene ay ipinakilala sa plasmid sa paraang ito ay katabi ng DNA promoter region, na nagbigay ng simula ng mRNA synthesis.

Mga extract mula sa E. Coli, naglalaman ng naturang plasmid , nagkaroon ng aktibidad na antiviral.

Ang interferon na na-synthesize ng genetic engineering ay isolated, purified, at ang physicochemical properties nito ay naging malapit sa interferon na nakuha mula sa donor blood. Nakakuha ng bakterya may kakayahan synthesize hanggang sa 5 mg ng interferon bawat 1 litro ng bacterial suspension na naglalaman ng humigit-kumulang 10 11 bacterial cells, na 5000 beses na mas malaki kaysa sa halaga ng interferon na maaaring makuha mula sa 1 litro ng donor blood.

Sa kasalukuyan, ang mga gene ng interferon ay na-clone sa lebadura at mas mataas na mga eukaryotic na selula na may kakayahang glycosylation.

Noong 1991, sa unang pagkakataon sa Estados Unidos, ginamit ang genetically engineered yeast cells upang synthesize ang interferon ng leukocyte ng tao. Saccharomyces cerevisiae. Ang nagresultang mahusay na pagpapahayag ng LeIF gene at ang pagpapalit ng bakterya na may mga selula ng lebadura ay naging posible upang madagdagan ang produksyon ng interferon ng 10 beses.

Sa Russia noong 1994, isang kumpletong synthesis ng gene ang isinagawa α- At mga 600 N ang laki. n. (mga nucleotide point) sa Institute of Bioorganic Chemistry sa ilalim ng direksyon ni N. M. Kolosov.

Sa kabila ng mga tagumpay na nakamit sa larangan ng pagkuha ng mga interferon gamit ang mga teknolohiyang genetic engineering at ang kanilang aplikasyon para sa paggamot ng iba't ibang mga sakit na viral, kabilang ang kanser, marami pa ring mga isyu na dapat lutasin tungkol sa pag-decipher ng mga mekanismo ng kanilang biosynthesis at pakikipag-ugnayan sa iba pang mga sangkap. .

Ang scheme ng biological action ng interferon ay ipinapakita sa Figure 8.34.

kanin. 8.34. Ang mekanismo ng pagkilos ng interferon

Ang mekanismo ng pagkilos ng interferon ay maaaring mabawasan sa mga sumusunod pangunahing yugto:

1. Sa pamamagitan ng pagbubuklod sa mga cellular receptor, pinasimulan ng mga interferon ang synthesis ng 5 "-oligoadenylan synthetase at protina kinase enzymes sa pamamagitan ng pagsisimula ng transkripsyon ng kaukulang mga gene;

2. Ang parehong mga enzyme ay nagpapakita ng kanilang aktibidad sa pagkakaroon ng double-stranded DNA, na mga produkto ng pagtitiklop ng maraming mga virus;

3. Ang enzyme na 5"-oligoadenylansynthetase ay nagpapagana ng synthesis ng 2" 5"-oligoadenylates (mula sa ATP), na nagpapagana ng cellular ribonuclease;

4. Protein kinase phosphorylates at sa gayon ay ina-activate ang translation initiation factor IF 2. Bilang resulta ng mga kaganapang ito, ang biosynthesis ng protina at pagpaparami ng virus (mRNA at rRNA degradation) sa nahawaang cell ay napipigilan, na nagiging sanhi ng lysis nito.

Paksa: Interferon. Pagkuha ng mga interferon.

Ang mga interferon ay natuklasan noong 1957 sa National Institute for Medical Research sa London bilang mga kadahilanan ng paglaban sa impeksyon sa viral. Napag-alaman na ang mga selula ng hayop na nakalantad sa virus ay nagtatago sa kapaligiran ng isang kadahilanan na may kakayahang magbigay ng paglaban sa mga malulusog na selula sa isang impeksyon sa virus: tila pinipigilan nito (nagagambala) sa pagpaparami ng mga virus sa selula at, dahil sa kakayahang ito, ay tinatawag na interferon. May tatlong uri ng interferon:

α, β, tinutukoy ang unang klase, γ-interferon, tinutukoy ang pangalawang klase.

Ang Interferon-α, na ginawa ng mga leukocytes, ay may nakararami na antiviral, antiproliferative at antitumor effect.

Ang Interferon-β, na nabuo ng mga fibroblast, ay may nakararami na antitumor at antiviral na epekto.

Ang Interferon -γ - ay ginawa ng T-lymphocytes at natural killer (NK-cells) at tinatawag na lymphocytic at immune. Ito ay may nakararami na immunomodulatory at mahinang antiviral effect.

Ang produksyon ng class I interferon ay na-induce ng mga virus, double-stranded RNA, synthetic double-stranded oligonucleotides, ang produksyon ng interferon - γ - viral at bacterial antigens o antisera laban sa surface determinants ng lymphocytes. Ang antiviral effect ng interferon ay dahil sa kakayahang i-activate ang synthesis ng dalawang enzymes sa mga cell - oligoadenylate synthetase at protein kinase, na pumipigil sa pagtitiklop ng protina ng virus sa nahawaang cell, na nagiging sanhi ng lysis nito. Ito ang parehong mekanismo ng antiproliferative antitumor action ng mga interferon.

Ang Interferon-γ ay isang polyfunctional immunomodulatory lymphokine na nakakaapekto sa paglaki at pagkakaiba-iba ng mga selula ng iba't ibang uri. Ina-activate nito ang mga macrophage sa yugto ng paglilipat ng antigenic na impormasyon sa isang lymphocyte, pinatataas ang kanilang aktibidad na antimicrobial at antitumor, at ang produksyon ng IL-1. IF-γ activates natural killers, cytotoxic lymphocytes na pumipigil sa paglaki ng tumor.

Ang mga interferon-α ay mga protina, at ang β at γ - interferon - glycoproteins, ang mga ito ay karaniwang mga globular na protina. Sa α-interferon, dalawang disulfide bond ang natagpuan. Ang mga interferon ay mababang molekular na timbang na protina ng 146-166 na residue ng amino acid, partikular sa species, i.e. interferon ng tao ay biologically aktibo sa katawan ng tao, murine - lamang sa katawan ng mouse.

Kabilang sa mga pinaka pinag-aralan na interferon ay ang α-interferon; ang bilang ng mga gene na naka-encode sa kanila ay humigit-kumulang 20; sila ay naisalokal sa ika-9 na kromosoma. Tungkol sa β-interferon, isang protina lamang ang nahiwalay na tumutugma sa β-interferon ng tao - interferon β 1 - halos lahat ng aktibidad ng antiviral ay tumutugma dito. Posible na ang genome ay naglalaman ng isang bilang ng mga gene na naka-encode ng iba't ibang β-interferon. Ang mga β-interferon gene ay naisalokal sa ika-9 na kromosoma. Ang Interferon-γ ay kinakatawan lamang ng isang indibidwal na protina, na naka-encode ng isang gene na matatagpuan sa ika-12 kromosoma.

Pagkuha ng mga interferon. Ang mga interferon ay nagsisilbing isa sa mga pinaka-epektibong paggamot para sa mga impeksyon sa viral, ngunit ang mga ito ay partikular sa mga species at maaari lamang makuha mula sa mga selula ng tao. Ang teknolohiya para sa paghihiwalay at paglilinis ng mga interferon ay hindi epektibo, pangunahin dahil sa napakababang ani ng pangwakas na produkto (1 μg lamang ng interferon ang maaaring ihiwalay mula sa 1 litro ng dugo, i.e. humigit-kumulang isang dosis para sa iniksyon).

Sa kasalukuyang yugto, ang pinaka-promising na paraan ay ang biosynthesis ng interferon gamit ang genetically engineered microorganisms. Ang mga cDNA na nakuha sa pamamagitan ng reverse transcription ay na-clone sa E. coli. Ang interferon gene ay ipinasok sa vector DNA, at ang mga bacterial regulatory elements ay nakakabit dito, na nagprograma ng transkripsyon at pagsasalin nito sa bacterial cell. Una, ang mga interferon sa cell ay na-synthesize sa anyo ng mga precursor na naglalaman ng isang signal peptide sa N-terminus ng polypeptide chain, na pagkatapos ay pinuputol, na nagreresulta sa pagbuo ng isang mature interferon na may ganap na biological na aktibidad. Ang bakterya ay hindi naglalaman ng mga enzyme na may kakayahang magtanggal ng signal peptide upang bumuo ng isang mature na protina. Samakatuwid, upang ma-synthesize ng bakterya ang mature na interferon, ang bahagi lamang ng gene na nag-encode nito ay dapat ipasok sa plasmid, at ang bahagi ng gene na nag-encode ng signal peptide ay dapat alisin. Ang pamamaraang ito ay isinagawa bilang mga sumusunod. Ang interferon gene ay naglalaman ng tatlong Sau 3A1 cleavage site, isa sa mga ito ay matatagpuan malapit sa signaling bahagi. Ang hindi kumpletong cleavage ng gene na may ganitong enzyme ay ginagawang posible na ihiwalay ang isang gene fragment na naglalaman ng nucleotide sequence na naka-encode sa mature na interferon, ngunit wala ang unang cysteine. Ang ATG triplet encoding cysteine ​​​​ay pinuputol ng enzyme kasama ang bahagi ng signal. Upang maibalik ang pagkakasunud-sunod ng polynucleotide ng kumpletong gene, isang maliit na fragment ng DNA ang na-synthesize ng kemikal na naglalaman ng triplet na ito, pati na rin ang triplet ng ATG na katabi nito, ang punto ng pagsisimula ng synthesis ng protina. Ang fragment na ito ay nakakabit sa nakahiwalay na bahagi ng mature na gene, at bilang resulta, ang kumpletong mature na interferon gene ay naibalik. Ang reconstructed gene ay ipinakilala sa plasmid sa paraang ito ay katabi ng DNA promoter region, na nagbigay ng simula ng mRNA synthesis. Ang mga extract mula sa E. coli na naglalaman ng plasmid na ito ay may aktibidad na antiviral. Ang interferon na na-synthesize ng genetic engineering ay isolated, purified, at ang physicochemical properties nito ay naging katulad ng interferon na nakuha mula sa donor blood. Posibleng makakuha ng bacteria na may kakayahang mag-synthesize ng hanggang 5 mg ng interferon bawat 1 litro ng bacterial suspension na naglalaman ng humigit-kumulang 1011 bacterial cells, na 5000 beses na mas malaki kaysa sa halaga ng interferon na maaaring makuha mula sa 1 litro ng donor blood.

Gamit ang mga teknolohiyang genetic engineering sa iba't ibang laboratoryo, ang mga strain ng bacteria na gumagawa ng iba't ibang interferon ay nakuha: α-, β- at γ-types. Ang kawalan ng paggamit ng E. coli upang makakuha ng β- at γ-interferon ay ang kakulangan ng isang glycosylation apparatus para sa mga eukaryotic protein sa bacterium, na humahantong sa synthesis ng mga non-glycolized molecule. At kahit na ang papel ng glycosylation ay hindi malinaw at ang mga non-glycolized β- at γ-interferon ay halos ganap na nagpapanatili ng kanilang aktibidad na antiviral, ang tampok na ito ay nagdidikta ng isang maingat na diskarte sa paggamit ng mga genetically engineered na gamot sa medikal na kasanayan.

Sa kasalukuyan, ang mga gene ng interferon ay na-clone sa lebadura at mas mataas na mga eukaryotic na selula na may kakayahang glycosylation. Noong 1981, sa unang pagkakataon sa Estados Unidos, ginamit ang genetically engineered na mga cell ng yeast Saccharomyces cerevisiae para sa synthesis ng human leukocyte interferon. Ang nagresultang mahusay na pagpapahayag ng LeIF gene at ang pagpapalit ng bakterya na may mga selula ng lebadura ay naging posible upang madagdagan ang produksyon ng interferon ng 10 beses.

Ang mga interferon ay ginawa bilang mga gamot sa anyo ng mga patak ng ilong, mga ointment at mga solusyon sa iniksyon. May mga natural na interferon na nakuha mula sa donor blood lymphocytes at artipisyal na na-synthesize gamit ang genetic engineering technologies (recombinant). Sa kasalukuyan, ang mga komersyal na paghahanda ay ginawa sa Russia at sa ibang bansa - human leukocyte, lymphoblastic (Velferon) at fibroblast (Feron), pati na rin ang mga interferon na nakuha ng mga pamamaraan ng genetic engineering: recombinant α-interferon (Roferon, Realderon, atbp.), β- interferon at γ-interferon (Gammaferon).

Interferon ay isa sa mga mahalagang proteksiyon na protina ng immune system. Natuklasan ito kapag pinag-aaralan ang interference ng mga virus, ibig sabihin, ang phenomenon kapag ang mga hayop o cell culture na nahawaan ng isang virus ay naging insensitive sa impeksyon ng isa pang virus. Ito ay lumabas na ang pagkagambala ay dahil sa nagresultang protina, na may proteksiyon na antiviral property. Ang protina na ito ay pinangalanang interferon.

Ang Interferon ay isang pamilya ng mga glycoprotein na protina na na-synthesize ng mga selula ng immune system at connective tissue. Depende sa kung aling mga cell ang nag-synthesize ng interferon, mayroong tatlong uri: α, β at γ-interferon.

Alpha interferon ginawa ng mga leukocytes at ito ay tinatawag na leukocyte; beta interferon tinatawag na fibroblastic, dahil ito ay synthesize ng fibroblasts - connective tissue cells, at gamma interferon - immune, dahil ito ay ginawa ng activated T-lymphocytes, macrophage, natural killers, i.e., immune cells.

Ang interferon ay patuloy na na-synthesize sa katawan, at ang konsentrasyon nito sa dugo ay pinananatili sa humigit-kumulang 2 IU / ml (1 internasyonal na yunit - ME ay ang halaga ng interferon na nagpoprotekta sa kultura ng cell mula sa 1 CPD 50 ng virus). Ang produksyon ng interferon ay tumataas nang husto kapag nahawaan ng mga virus, gayundin kapag nalantad sa mga interferon inducers, tulad ng RNA, DNA, mga kumplikadong polimer. Ang ganitong mga interferon inducers ay tinatawag interferonogens.

Bilang karagdagan sa antiviral effect, ang interferon ay may proteksyon sa antitumor, dahil inaantala nito ang paglaganap (pagpaparami) ng mga selula ng tumor, pati na rin ang aktibidad ng immunomodulatory, pagpapasigla ng phagocytosis, natural na mga pumatay, pag-regulate ng pagbuo ng antibody ng mga selulang B, pag-activate ng pagpapahayag ng pangunahing histocompatibility. kumplikado.

Mekanismo ng pagkilos Ang interferon ay kumplikado. Ang interferon ay hindi direktang kumikilos sa virus sa labas ng cell, ngunit nagbubuklod sa mga espesyal na receptor ng cell at nakakaapekto sa proseso ng pagpaparami ng virus sa loob ng cell sa yugto ng synthesis ng protina.

Ang paggamit ng interferon. Ang pagkilos ng interferon ay mas epektibo, mas maaga itong nagsisimulang ma-synthesize o pumasok sa katawan mula sa labas. Samakatuwid, ito ay ginagamit para sa prophylactic na layunin sa maraming mga impeksyon sa viral, tulad ng trangkaso, pati na rin para sa mga layuning panterapeutika sa mga talamak na impeksyon sa viral, tulad ng parenteral hepatitis (B, C, D), herpes, multiple sclerosis, atbp. Interferon ay nagbibigay ng positibo nagreresulta sa paggamot ng mga malignant na tumor at mga sakit na nauugnay sa immunodeficiencies.

Ang mga interferon ay partikular sa mga species, ibig sabihin, ang interferon ng tao ay hindi gaanong epektibo para sa mga hayop at vice versa. Gayunpaman, ang pagtitiyak ng species na ito ay kamag-anak.

Pagkuha ng interferon. Ang interferon ay nakuha sa dalawang paraan: a) sa pamamagitan ng pag-infect ng mga leukocytes o lymphocytes ng tao na may ligtas na virus, bilang isang resulta kung saan ang mga nahawaang selula ay nag-synthesize ng interferon, na pagkatapos ay nakahiwalay at ang mga paghahanda ng interferon ay itinayo mula dito; b) sa pamamagitan ng genetic engineering - sa pamamagitan ng paglaki sa ilalim ng mga kondisyong pang-industriya recombinant bacterial strains na may kakayahang gumawa ng interferon. Karaniwan, ginagamit ang mga recombinant strain ng Pseudomonas, Escherichia coli na may mga interferon gene na naka-embed sa kanilang DNA. Ang interferon na nakuha sa pamamagitan ng genetic engineering ay tinatawag na recombinant. Sa ating bansa, ang recombinant interferon ay nakatanggap ng opisyal na pangalan na "Reaferon". Ang produksyon ng gamot na ito ay mas mahusay at mas mura kaysa sa leukocyte na gamot.

Ang recombinant interferon ay natagpuan ng malawak na aplikasyon sa medisina bilang isang prophylactic at therapeutic agent para sa mga impeksyon sa viral, neoplasms, at immunodeficiencies.

Mga antigen. Kahulugan. Ang konsepto ng kumpleto at may sira na antigens. mga kinakailangan para sa antigens. Mga konsepto tungkol sa mga antigenic na katangian ng mga microorganism. Antigenic na istraktura ng bakterya.

Mga antigen(mula sa Latin na anti - laban, genos - genus) - mga genetically alien substance na, kapag ipinakilala sa panloob na kapaligiran ng katawan, ay maaaring maging sanhi ng immune response sa anyo ng pagbuo ng mga antibodies o immune T-lymphocytes at nakikipag-ugnayan sa kanila. Ang mga pangunahing katangian ng isang antigen ay immunogenicity at specificity. Ang mga antigen ay mga istruktura at kemikal na elemento ng mga selula at mga produkto ng kanilang metabolismo.

Ang mga antigens ay mga sangkap ng isang koloidal na istraktura na dayuhan sa katawan, na, kapag inilabas sa panloob na kapaligiran nito, ay may kakayahang magdulot ng isang tugon na tiyak na reaksyon ng immunological, na nagpapakita mismo, lalo na, sa pagbuo ng mga tiyak na antibodies, ang hitsura ng mga sensitized lymphocytes. , o sa paglitaw ng isang estado ng pagpapaubaya sa sangkap na ito.

Ang mga sangkap na antigens ay dapat na banyaga sa katawan, macromolecular, nasa isang colloidal na estado, pumasok sa katawan nang parenteral, i.e. pag-bypass sa gastrointestinal tract, kung saan kadalasang nangyayari ang pagkasira ng sangkap at pagkawala ng pagiging dayuhan nito. Ang pagiging dayuhan ng mga antigen ay dapat na maunawaan bilang isang tiyak na antas ng kemikal na pagkakaiba sa pagitan ng antigen at mga macromolecule ng organismo, sa panloob na kapaligiran kung saan hindi ito pumapasok.

Ang mga katangian ng antigenic ay nauugnay sa bigat ng molekular ng macromolecule. Kung mas mataas ang molecular weight ng isang substance, mas mataas ang antigenicity nito. Kasabay nito, hindi tama na ipalagay na ang isang mataas na molekular na timbang ay isang ipinag-uutos na pag-aari ng isang antigen. Kaya, ang glucagon, vasopressin - angiotensin ay mayroon ding mga antigenic na katangian.

Nakaugalian na ang pagkakaiba sa pagitan ng kumpletong antigens, may sira na antigens (haptens) at semi-haptens.

Ang buong antigens ay tinatawag na mga sanhi ng pagbuo ng mga antibodies o sensitization ng mga lymphocytes at nagagawang tumugon sa kanila kapwa sa katawan at sa mga reaksyon sa laboratoryo. Ang mga protina, polysaccharides, high-molecular nucleic acid at kumplikadong compound ng mga sangkap na ito ay may mga katangian ng ganap na antigens.

Ang mga may sira na antigens, o haptens, sa kanilang mga sarili ay hindi kayang mag-udyok sa pagbuo ng antibody o lymphocyte sensitization. Ang katangiang ito ay lilitaw lamang kapag ang mga kumpletong antigens ("konduktor") ay idinagdag sa kanila, at kabilang sa mga nagresultang antibodies o sensitized na mga lymphocyte, ang ilan ay tiyak sa "konduktor", at ang ilan ay tiyak sa hapten.

Ang mga semi-hapten ay medyo simpleng mga sangkap na, sa pagpasok sa panloob na kapaligiran ng isang organismo, ay maaaring kemikal na pagsamahin sa mga protina ng organismo na ito at bigyan sila ng mga katangian ng antigens. Ang ilang mga gamot (iodine, bromine, antipyrine, atbp.) ay maaari ding kabilang sa mga sangkap na ito.

Ang molekula ng antigen ay binubuo ng dalawang hindi pantay na bahagi. Ang aktibo (maliit na bahagi) ng c ay tinatawag na antigenic determinant (epitope) at tinutukoy ang antigenic specificity. Ang mga antigenic determinant ay matatagpuan sa mga lugar na iyon ng molekula ng antigen na pinaka konektado sa microenvironment. Sa isang molekula ng protina, halimbawa, maaari silang matatagpuan hindi lamang sa mga dulo ng polypeptide chain, kundi pati na rin sa iba pang mga bahagi nito. Ang mga antigenic determinant ay naglalaman ng hindi bababa sa tatlong amino acid na may matibay na istraktura (tyrosine, tryptophan, phenylalanine). Ang pagtitiyak ng antigen ay nauugnay din sa pagkakasunud-sunod ng paghahalili ng mga amino acid ng polypeptide chain at ang kumbinasyon ng kanilang mga posisyon na nauugnay sa bawat isa. Ang bilang ng mga antigenic determinants sa isang antigen molecule ay tumutukoy sa valency nito. Ito ay mas mataas, mas malaki ang kamag-anak na molekular na timbang ng molekula ng antigen.

Ang natitirang bahagi (hindi aktibo) na bahagi ng molekula ng antigen ay pinaniniwalaan na gumaganap ng papel ng isang determinant carrier at nagtataguyod ng pagtagos ng antigen sa panloob na kapaligiran ng katawan, ang pinocytosis o phagocytosis nito, ang cellular reaksyon sa pagtagos ng antigen, ang pagbuo ng mga mediator ng intercellular na pakikipag-ugnayan sa immune response (T-lymphocytes ay may mga receptor para sa carrier , B- sa antigenic determinant).

Ayon sa anatomical na istruktura ng isang bacterial cell, mayroong H-antigens (flagelated, kung ang bacterium ay mayroon nito), K-antigens (na matatagpuan sa ibabaw ng cell wall), O-antigens (na nauugnay sa cell wall ng bacteria. ), mga antigen na pinalabas ng bakterya sa kanilang kapaligiran (proteins- exotoxins, capsule polysaccharides).

Kabilang sa maraming antigens ng microbial cell, mayroong mga likas lamang sa isang partikular na uri ng microbes (type antigens), isang partikular na species (species antigens), pati na rin karaniwan sa isang grupo (pamilya) ng mga microorganism (group antigens). ).

Kaya, ang bacterial cell (tulad ng mga microorganism ng ibang kaharian ng microbes - mga virus, protozoa, fungi) ay isang kumplikadong complex ng maraming antigens. Kapag ito ay pumasok sa panloob na kapaligiran ng macroorganism, marami sa mga antigen na ito ay bubuo ng kanilang sariling mga tiyak na antibodies. Ang ilang mga antigens ay nag-uudyok sa pagbuo ng isang bahagya na kapansin-pansing halaga ng mga antibodies (titer), ang iba - mabilis at makabuluhang produksyon ng antibody. Alinsunod dito, ang "mahina" at "malakas" na antigens ay nakikilala.

Hindi lahat ng antigens ng isang bacterial cell ay pantay na kasangkot sa induction ng resistensya (immunity) sa muling pagpasok ng mga pathogenic microbes ng parehong species sa macroorganism. Ang kakayahan ng isang antigen na magdulot ng immunity ay tinatawag na immunogenicity, at ang naturang antigen ay tinatawag na immunogen. Napag-alaman din na ang ilang antigens ng ilang microorganism ay maaaring maging sanhi ng pag-unlad ng iba't ibang uri ng hypersensitivity (allergy). Ang ganitong mga antigen ay tinatawag na allergens.

Ayon sa istraktura ng viral particle, maraming mga grupo ng mga antigens ang nakikilala: nuclear, capsid at supercapsid. Ang antigenic na komposisyon ng virion ay depende sa istraktura ng viral particle mismo. Ang antigenic specificity ng simpleng organisadong mga virus ay nauugnay sa ribo- at deoxynucleoproteins. Sa kumplikadong mga virus, ang bahagi ng antigen ay nauugnay sa nucleocapsid, at ang isa ay naisalokal sa panlabas na shell - ang supercapsid.

Immunogenicity- ang kakayahang magbuod ng immune response.

Pagtitiyak- ang kakayahan ng isang antigen na pumasok sa mga reaksyon ng pakikipag-ugnayan sa mga antibodies na tiyak dito o activated (primed) lymphocytes, na humahantong sa neutralisasyon ng antigen na ito.

Natutukoy ang immunogenicity:

pagiging banyaga, mga. ang sangkap ay dapat kilalanin ng immune system bilang "hindi sa sarili". Bukod dito, ang hindi gaanong binibigkas ang genetic na relasyon sa pagitan ng organismo at ang pinangangasiwaan na sangkap, mas mahusay na immunogen ito;

molekular na timbang, na dapat ay hindi bababa sa 5-10 kD. Kung mas malaki ang molekular na timbang ng antigen, mas malakas ang immune response;

kemikal na kalikasan. Ang mga antigen ay maaaring mga protina, polysaccharides, polypeptides, phospholipids, nucleic acids, atbp.

Depende sa kemikal na kalikasan at molekular na timbang, ang mga antigen ay maaaring kumpleto at hindi kumpleto

(humarap).

Kumpletong antigens(immunogens) mag-udyok ng isang tiyak na immune response at nakikipag-ugnayan sa mga antibodies at activated T-lymphocytes. Ito ay mga macromolecular substance - mga protina, polysaccharides, glycoproteins, lipopolysaccharides, lipoproteins, nucleoproteins at corpuscular forms (microorganisms, foreign cells, atbp.). Ang mga antigen ay maaaring exogenous o endogenous. Endogenous AG - sariling mga selula ng katawan na may binagong genome at ang mga produktong nabuo nito ( autoantigens).

Haptens- ito ay mga simpleng kemikal na compound na may maliit na molekular na timbang: disaccharides, lipids, peptides, nucleic acids, atbp. Hindi sila immunogenic, ngunit may mataas na antas ng pagtitiyak kapag nakikipag-ugnayan sa mga produkto ng immune response (antibodies at T-lymphocytes) . Kung ang hapten ay pinagsama sa isang protina, nakukuha nito ang pag-aari ng immunogenicity (ibig sabihin, ito ay nagiging kumpleto). Ang pagtitiyak ng kumplikadong ito ay tinutukoy ng hapten

Semi-haptens

Proantigens

Semi-haptens ay nabuo kapag ang mga inorganikong sangkap (iodine, bromine, nitrogen, atbp.) ay pinagsama sa protina. Ang ganitong mga complex ay maaaring magbuod ng pagbuo ng mga antibodies na tiyak sa mga inorganikong compound.

Proantigens ay mga allergens-haptens o non-antigenic substance (sulfonamides, antibiotics, phenolphthalein, atbp.). Kapag pinagsama sa mga protina ng macroorganism, maaari silang maging sanhi ng isang estado ng sensitization at pag-unlad ng mga reaksiyong alerdyi.

Semi-haptens ay nabuo kapag ang mga inorganikong sangkap (iodine, bromine, nitrogen, atbp.) ay pinagsama sa protina. Ang ganitong mga complex ay maaaring magbuod ng pagbuo ng mga antibodies na tiyak sa mga inorganikong compound.

Proantigens ay mga allergens-haptens o non-antigenic substance (sulfonamides, antibiotics, phenolphthalein, atbp.). Kapag pinagsama sa mga protina ng macroorganism, maaari silang maging sanhi ng isang estado ng sensitization at pag-unlad ng mga reaksiyong alerdyi.

Noong 1957, natuklasan ng mga siyentipiko na ang mga cell na nahawaan ng isang virus ay gumagawa ng isang espesyal na sangkap na pumipigil sa pagpaparami ng parehong homologous at heterologous na mga virus, na tinatawag nilang interferon. Kung ang immune system ay nagbibigay ng protina homeostasis at nag-aalis ng mga dayuhang genetic na impormasyon sa pamamagitan nito, kung gayon ang interferon system ay direktang nakakaapekto sa dayuhang genetic na impormasyon, inaalis ito mula sa katawan sa antas ng cellular, at sa gayon ay tinitiyak ang nucleic homeostasis. Ang interferon system ay malapit na nakikipag-ugnayan sa immune system.
Ang mga interferon ay naka-encode sa genetic apparatus ng cell. Ang mga gene para sa interferon ng fibroblast ng tao ay matatagpuan sa ika-2, ika-9 at mahabang braso ng ika-5 kromosoma, ang gene na nagreregula ng transkripsyon ay nasa maikling braso ng parehong kromosoma. Ang gene na tumutukoy sa pagkamaramdamin sa pagkilos ng interferon ay naisalokal sa 21st chromosome. Ang gene para sa α-interferon ay matatagpuan sa 9th chromosome, para sa γ-interferon - sa 11th chromosome.
Ang sistema ng interferon ay walang sentral na organ, dahil ang lahat ng mga selula ng katawan ng mga vertebrates ay may kakayahang gumawa ng interferon, bagaman ang mga puting selula ng dugo ay pinaka-aktibong gumagawa nito.
Ang interferon ay hindi kusang ginawa ng mga buo na selula at kailangan ang mga inducers para sa pagbuo nito, na maaaring mga virus, bacterial toxins, extracts mula sa fungal bacteria, phytohemagglutinins, synthetic substances - polycarboxylates, polysulfates, dextrans, ngunit ang pinaka-epektibong interferon inducers ay double-stranded. RNA: double-stranded viral RNA double-stranded synthetic copolymers ng ribonucleotides (poly-GC, poly-IC), atbp. Ang induction ng interferon ay nangyayari dahil sa derepression ng mga gene nito.
Mga uri ng interferon. Tatlong uri ng interferon ng tao ang kilala: α-interferon, o leukocyte interferon, na ginawa ng mga leukocyte na ginagamot sa mga virus at iba pang mga ahente; β-interferon, o fibroblast interferon, na ginawa ng mga fibroblast na ginagamot sa mga virus at iba pang mga ahente. Pareho sa mga interferon na ito ay nabibilang sa uri 1. Ang mas malakas na γ-interferon, o immune interferon, ay kabilang sa uri 2. Mayroong ilang mga subtype ng α-interferon, at ang kanilang kabuuang bilang sa mga tao ay umabot sa 25. Ang mga paghahambing na katangian ng mga interferon ng tao ay ibinibigay sa ang lamesa. Ang aktibidad ng interferon ay sinusukat sa mga internasyonal na yunit (ME). Ang isang yunit ay tumutugma sa dami ng interferon na pumipigil sa pagpaparami ng virus ng 50%.
Sa panahon ng induction ng mga interferon, dalawa o higit pa sa mga uri nito ay synthesized. Kaya, sa panahon ng induction ng interferon sa mga lymphoblast, 87% ng leukocyte at 13% ng fibroblast interferon ay nabuo, kasama ang induction ng interferon sa fibroblasts, ang mga kabaligtaran na relasyon ay nagaganap. Maaaring umiral ang mga synergistic na pakikipag-ugnayan sa pagitan ng tatlong uri ng interferon.

talahanayan 2
Mga paghahambing na katangian ng interferon ng tao

Mga katangian ng interferon. Ang mga interferon ay partikular sa mga species. Nangangahulugan ito na ang interferon ng tao ay aktibo lamang sa katawan ng tao, ngunit hindi aktibo sa katawan ng iba pang biological species. Siyempre, ang mga hadlang sa pagtitiyak ng mga species ay hindi ganap: ang interferon ng tao ay nagpapakita ng ilang aktibidad sa mga tisyu ng mga dakilang apes, acrine interferon sa katawan ng mga kaugnay na species ng pamilya ng manok. Gayunpaman, ang aktibidad ng interferon sa mga heterogenous na organismo ay nabawasan nang husto.
Samakatuwid, maaari itong tapusin na ang mga interferon, na lumitaw sa mga vertebrates, ay umunlad kasama ng kanilang mga host. Ang interferon ay isang medyo matatag na protina at pinahihintulutan ang mga acidic na kapaligiran (pH2.2), na ginagamit upang ihiwalay at linisin ito. Ang mga antigenic na katangian ng interferon ay hindi masyadong binibigkas, samakatuwid, ang mga antibodies dito ay maaari lamang makuha pagkatapos ng maraming pagbabakuna.
Ang mga interferon ay walang pagtitiyak laban sa mga virus at nakapanlulumong kumilos sa pagpaparami ng iba't ibang mga virus, bagaman ang iba't ibang mga virus ay may hindi pantay na sensitivity sa kinterferon. Ang pagiging sensitibo dito ay kadalasang kasabay ng syndusive na aktibidad ng kinterferon. Ang pinakakaraniwang ginagamit na interferon inducers at test virus para sa titration nito ay rhabdoviruses (vesicular stomatitis virus), paramyxoviruses, at togaviruses. Ang paggawa ng interferon ay nakasalalay din sa likas na katangian ng mga cell na ginamit. May mga cell na may depekto sa ilang interferon genes.
Ang mga interferon ay may antiviral, antitumor, immunomodulatory at iba pang mga aksyon. Ang kanilang antiviral na aksyon ay pinaka-pinag-aralan, at ito ay sa mga viral na modelo na ang biological at iba pang mga katangian ng mga interferon ay naipaliwanag.
Ang interferon ay may epekto na antitumor kapag pinangangasiwaan nang parenteral sa mataas na dosis, na nauugnay sa pagsugpo sa aktibidad ng cytoproliferative. Ang pagdaragdag ng interferon sa kultura ng mga normal na selula ay sinamahan na pagkatapos ng 2 h sa pamamagitan ng pagsugpo sa kanilang DNA synthesis. Sa mga tumor na dulot ng virus, pinipigilan ng interferon ang pagpaparami ng mga oncovirus at sabay na pinipigilan ang aktibidad ng cytoproliferative.
Ang interferon ay isang regulator ng iba't ibang mga mekanismo ng immune response, na nagbibigay ng stimulating o depressing effect sa immune response.
Ang mekanismo ng pagkilos ng interferon. Ang interferon ay nagbubuklod sa mga cellular receptor na matatagpuan sa lamad ng plasma, na nagsisilbing senyales para sa derepression ng kaukulang mga gene. Bilang isang resulta, ang synthesis ng isang espesyal na protina kinase PKs ay sapilitan, na kung saan ay naroroon sa mga bakas na halaga sa lahat ng mga selula ng mammalian at isinaaktibo sa pamamagitan ng mababang konsentrasyon ng double-stranded RNA, at sa mga cell na nahawaan ng virus - sa pamamagitan ng mga viral replication complex.
Ang protina kinase ay nagpo-phosphorylate sa a-subunit ng initiating translation factor eIF-2, at hinaharangan ng phosphorylation ang aktibidad ng initiating factor. Bilang isang resulta, ang mRNA na nauugnay sa initiation complex ay hindi maaaring magbigkis sa malaking ribosomal subunit, at samakatuwid ang pagsasalin nito ay naharang. Ang pagsisimula ng kadahilanan na eIF-2 ay pantay na kinakailangan para sa pagsasalin ng parehong cellular at viral mRNA, ngunit ang pagsasalin ng mga viral mRNA na nauugnay sa mga istruktura ng viral na double-stranded na RNA ay higit na naharang bilang isang resulta ng lokal na pag-activate ng protina kinase.
Sa mga cell na ginagamot sa interferon, ang synthesis ng enzyme synthetase ay sapilitan, na catalyzes 2,5-oligoadenylic acid, na lumipat sa pagkilos ng mga cellular nucleases sa pagkasira ng viral mRNA. Kaya, ang mga viral mRNA ay pinapasama ng mga nucleases. Ang pagharang sa pamamagitan ng interferon ng yugto ng pagsisimula ng pagsasalin at pagkasira ng mRNA ay tumutukoy sa unibersal na mekanismo ng pagkilos nito sa mga impeksiyon na dulot ng mga virus na may iba't ibang genetic na materyal.
Ang paggamit ng interferon. Ang mga interferon ay ginagamit upang maiwasan at gamutin ang isang bilang ng mga impeksyon sa viral. Ang kanilang epekto ay tinutukoy ng dosis ng gamot, ngunit ang mataas na dosis ng interferon ay may nakakalason na epekto. Ang mga interferon ay malawakang ginagamit para sa trangkaso at iba pang mga talamak na sakit sa paghinga. Ang gamot ay epektibo sa mga unang yugto ng sakit, inilapat nang topically, halimbawa, sa pamamagitan ng instillation o paglanghap ng upper respiratory tract sa mga konsentrasyon hanggang sa 3∙104-5∙104 units 2-3 beses sa isang araw. Sa conjunctivitis, ang interferon ay ginagamit sa anyo ng mga patak ng mata. Ang mga interferon ay may therapeutic effect sa hepatitis B, herpes, pati na rin sa malignant neoplasms. Sa mga sakit na ito, ang mas mataas na konsentrasyon ay inireseta. Ang gamot ay ginagamit parenterally - intravenously at intramuscularly sa isang dosis ng 105 mga yunit bawat 1 kg ng timbang ng katawan. Ang mas mataas na dosis ay may mga side effect (lagnat, sakit ng ulo, pagkawala ng buhok, malabong paningin, atbp.). Ang interferon ay maaari ring maging sanhi ng lymphopenia, naantala na pagkahinog ng macrophage, sa mga bata - malubhang kondisyon ng pagkabigla, sa mga pasyente na may mga sakit sa cardiovascular - myocardial infarction. Ang paglilinis ng interferon ay makabuluhang binabawasan ang toxicity nito at pinapayagan ang paggamit ng mataas na konsentrasyon. Ang paglilinis ay isinasagawa sa pamamagitan ng affinity chromatography gamit ang monoclonal antibodies sa kinterferon.
Genetically engineered interferon. Ang genetically engineered leukocyte interferon ay nakukuha sa prokaryotic system (E. coli). Kasama sa biotechnology para sa pagkuha ng interferon ang mga sumusunod na hakbang:
1) paggamot ng leukocyte mass na may interferon inducers;
2) paghihiwalay ng pinaghalong mRNA mula sa ginagamot na mga cell;
3) pagkuha ng kabuuang komplementaryong DNA (cDNA) gamit ang reverse transcriptase;
4) pagpasok ng cDNA sa Escherichia coli plasmid at pag-clone nito;
5) pagpili ng mga clone na naglalaman ng mga interferon genes;
6) pagsasama ng isang malakas na tagataguyod sa plasmid para sa matagumpay na transkripsyon ng gene;
7) pagpapahayag ng interferon gene, i.e. synthesis ng kaukulang protina;
8) pagkasira ng mga prokaryotic cells at paglilinis ng interferon gamit ang affinity chromatography.
Ang mataas na purified at puro interferon na paghahanda ay nakuha, na sinusuri sa klinika.
Human leukocyte interferon, katutubong at puro, ay inilaan para sa pag-iwas at paggamot ng trangkaso at iba pang mga viral respiratory disease.
Ang leukocyte interferon ay isang protina na partikular sa species na na-synthesize ng mga leukocyte ng tao bilang tugon sa mga epekto ng interferonogen virus. Ang interferon ay walang pumipili na aktibidad na antiviral at kumikilos sa halos lahat ng mga virus.
Para sa paghahanda ng interferon, ginagamit ang mga leukocytes ng bagong nakuha na dugo ng donor. Sa ilalim ng impluwensya ng isang virus - interferonogen, ang mga leukocytes sa medium ng kultura ay synthesize interferon. Pagkatapos ang mga leukocytes ay tinanggal sa pamamagitan ng centrifugation, ang virus ay hindi aktibo. Ang gamot ay isang katutubong interferon. Upang makakuha ng puro katutubong interferon, ito ay dinadalisay ng chromatographic separation sa mga column na may sephadex.
Ang interferon ay ginawa sa dry form sa ampoules. Ang native dry interferon ay isang grayish-brown porous powder na madaling natutunaw sa distilled water. Ang natunaw na gamot ay may pinkish-red na kulay na may sopalescence. Ang isang bahagyang kayumanggi na lilim ng solusyon ay pinapayagan. Ang concentrated dry preparation ay isang porous grayish-white powder, na madali ding natutunaw sa distilled water. Ang solusyon ng gamot ay may kulay-abo na kulay na may copalescence, sabihin nating isang bahagyang madilaw-dilaw na kayumanggi na kulay. Ang mga dayuhang dumi ay hindi dapat maglaman.
Human leukocyte interferon ay ginawa virologically at bacteriologically sterile. Ang aktibidad ng antiviral ng katutubong gamot ay dapat na hindi bababa sa 32 mga yunit, puro - 100 mga yunit. Natutukoy ang aktibidad sa pamamagitan ng titration sa pangunahing cell culture ng musculoskeletal tissue ng isang embryo ng tao na may vesicular stomatitis virus.
Walang mga kontraindiksyon sa paggamit ng gamot. Ang interferon ay hindi reaktibo, hindi nagiging sanhi ng mga side effect.
Ang gamot ay nakaimbak sa temperatura na 4 °C. Shelf life 1 taon. Pagkatapos ng pag-expire nito, ang isang re-control ay maaaring isagawa ng institute na gumawa ng seryeng ito ng gamot. Habang pinapanatili ang mga pisikal na katangian at aktibidad, ang shelf life ng gamot ay maaaring pahabain ng isa pang 3 buwan.

interferon leukocyte gene virus

Sa kasalukuyan, ang paraan ng pagkuha ng interferon sa pamamagitan ng microbiological synthesis ay kinikilala bilang mas promising, na ginagawang posible na makuha ang target na produkto na may mas mataas na ani mula sa isang medyo murang hilaw na materyal. Ang mga diskarte na ginamit sa kasong ito ay ginagawang posible na lumikha ng mga variant ng structural gene na pinakamainam para sa pagpapahayag ng bacterial, pati na rin ang mga elemento ng regulasyon na kumokontrol sa pagpapahayag nito.

Ang iba't ibang disenyo ng Pichia pastoris, Pseudomonas putida at Escherichia coli strains ay ginagamit bilang mga paunang mikroorganismo.

Ang kawalan ng paggamit ng P. pastoris bilang isang tagagawa ng interferon ay ang napakahirap na kondisyon ng pagbuburo para sa ganitong uri ng lebadura, ang pangangailangan na mahigpit na mapanatili ang konsentrasyon ng inducer, sa partikular na methanol, sa panahon ng biosynthesis.

Ang kawalan ng paggamit ng mga strain ng Ps. putida ay ang pagiging kumplikado ng proseso ng pagbuburo sa mababang antas ng pagpapahayag (10 mg ng interferon bawat 1 litro ng medium ng kultura). Mas produktibo ang paggamit ng Escherichia coli strains.

Ang isang malaking bilang ng mga plasmids at interferon-expressing E. coli strains ay kilala: E. coli strains ATCC 31633 at 31644 na may plasmids Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 o Z-pBR 322(Pstl)/HclN SN 35 - AHL6 (SU 1764515), E. coli strain pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli strain pINF-F-Pa (AU 1312962), E. coli strain SG 20050 na may p280/21FN plasmid, E. coli strain SG 2005 na may pINF14 plasmid (SU 1703691), E. coli SG 20050 strain na may pINF16 plasmid (RU 2054041), atbp. Ang kawalan ng mga teknolohiya batay sa paggamit ng mga strain na ito ay ang kanilang kawalang-tatag, pati na rin ang hindi sapat na antas ng interferon expression.

Kasama ang mga katangian ng mga strain na ginamit, ang kahusayan ng proseso ay higit na nakasalalay sa teknolohiyang ginamit para sa paghihiwalay at paglilinis ng interferon.

Isang kilalang paraan para sa paggawa ng interferon, na kinabibilangan ng paglilinang ng mga cell Ps. putida, biomass destruction, polyethyleneimine treatment, ammonium sulphate fractionation, hydrophobic chromatography sa phenylsilochrome C-80, pH fractionation ng lysate, konsentrasyon at diafiltration nito, ion-exchange chromatography sa DE-52 cellulose, pH gradient elution, chromatography ng chromatography nagreresultang eluent sa CM cellulose -52, konsentrasyon sa pamamagitan ng pagpasa sa isang filter cassette at gel filtration sa Sephadex G-100 (SU 1640996). Ang kawalan ng pamamaraang ito, bilang karagdagan sa kumplikadong multi-stage fermentation, ay ang multi-stage na proseso sa pagkuha ng huling produkto.

Mayroon ding kilala na paraan para sa paggawa ng interferon, na kinabibilangan ng paglilinang ng E. coli SG 20050/pIF16 strain sa LB broth sa mga flasks sa isang thermostated shaker, pagse-centrifuge ng biomass, paghuhugas nito ng buffer solution at pag-sonicate para sirain ang mga cell. Ang resultang lysate ay centrifuged, hugasan ng 3 M urea sa buffer, dissolved sa guanidine chloride sa buffer, sonicated, centrifuged, oxidative sulfitolysis, dialysis laban sa 8 M urea, renaturation, at final two-stage chromatography sa CM-52 cellulose at Sephadex G -50 ( EN 2054041) .

Ang mga disadvantages ng pamamaraang ito ay ang relatibong mababang produktibidad ng mga pangunahing yugto ng proseso ng paghihiwalay at paglilinis. Sa partikular, nalalapat ito sa pagproseso ng ultrasonic ng produkto, dialysis at oxidative sulfitolysis, na humahantong sa kawalang-tatag sa ani ng interferon, pati na rin ang imposibilidad ng paggamit ng pamamaraang ito para sa pang-industriyang produksyon ng interferon.

Bilang ang pinakamalapit na analogue (prototype), ang isang paraan para sa pagkuha ng interferon ng leukocyte ng tao ay maaaring ipahiwatig, na binubuo sa paglilinang ng isang recombinant E. coli strain, pagyeyelo ng nagresultang biomass sa isang temperatura na hindi hihigit sa -70 ° C, lasaw, pagsira sa mga selula ng microorganism na may lysozyme, pag-alis ng DNA at RNA sa pamamagitan ng pagpapasok sa DNase lysate at pagdalisay ng nakahiwalay na insoluble form ng interferon sa pamamagitan ng paghuhugas gamit ang buffer solution na may mga detergent, pagtunaw ng precipitate ng interferon sa solusyon ng guanidine hydrochloride, renaturation at one-stage purification sa pamamagitan ng ion -magpalitan ng chromatography. Bilang isang producer, ang E. coli SS5 strain na nakuha gamit ang recombinant pSS5 plasmid na naglalaman ng tatlong promoter: Plac, Pt7 at Ptrp, at ang alpha-interferon gene na may ipinakilala na mga pagpapalit ng nucleotide ay ginagamit.

Ang pagpapahayag ng interferon ng E. coli SS5 strain na naglalaman ng plasmid na ito ay kinokontrol ng tatlong promoter: Plac, Pt7 at Ptrp. Ang antas ng pagpapahayag ng interferon ay humigit-kumulang 800 mg bawat 1 litro ng suspensyon ng cell.

Ang kawalan ng pamamaraang ito ay ang mababang manufacturability ng paggamit ng enzymatic na pagkasira ng mga cell, DNA at RNA ng microorganism at isang yugto ng chromatographic purification ng interferon. Nagdudulot ito ng kawalang-tatag ng proseso ng paghihiwalay ng interferon, humahantong sa pagbaba sa kalidad nito at nililimitahan ang posibilidad ng paggamit ng pamamaraan sa itaas para sa pang-industriyang produksyon ng interferon.

Ang mga disadvantages ng plasmid na ito at ang strain batay dito ay ang paggamit sa plasmid ng isang malakas na unregulated T7 phage promoter sa E. coli BL21 (DE3) strain, kung saan ang T7 RNA polymerase gene ay nasa ilalim ng lac operon promoter at kung saan laging "daloy". Dahil dito, ang synthesis ng interferon ay patuloy na nangyayari sa cell, na humahantong sa dissociation ng plasmid at isang pagbawas sa viability ng mga cell ng strain, at bilang isang resulta, isang pagbawas sa ani ng interferon.

Isang halimbawa ng pagkuha ng recombinant interferon:

600 g ng biomass ng Pseudomonas putida 84 na mga cell na naglalaman ng recombinant p VG-3 plasmid ay naglalaman ng 130 mg ng alpha-2 interferon pagkatapos ng paglilinang. Ang mga cell ay na-load sa isang ballistic disintegrator na may mechanical stirrer na may kapasidad na 5.0 l at 3.0 l ng lysis buffer na naglalaman ng 1.2% sodium chloride, 1.2% tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, 10% sucrose, 0 15% ethylenediaminetetraacetic acid ( EDTA), 0.02% phenylmethylsulfonyl fluoride at 0.01% dithiothreitol sa pH 7.7. Ang biomass ay hinalo hanggang ang isang homogenous na suspensyon ay nakuha sa loob ng 30 min, pagkatapos ay naghiwa-hiwalay sa mode ng sirkulasyon sa isang ballistic disintegrator alinsunod sa mga tagubilin sa pagpapatakbo. Ang oras ng disintegration ay 1.5 na oras. Nakumpleto ang proseso ng disintegration noong, sa panahon ng mikroskopya ng paghahanda, halos walang buong cell ng mga microorganism ang naobserbahan sa ilang mga larangan ng view ng mikroskopyo. Ang dami ng lysed biomass suspension ay 3.5 litro.

Ang lysate na nakuha sa yugtong ito pagkatapos ay pumasok sa yugto ng pag-ulan ng mga nucleic acid. Upang gawin ito, ang 180 ml ng isang 5% na solusyon ng polyethyleneimine ay idinagdag sa lalagyan na naglalaman ng lysate na may pagpapakilos sa isang rate ng 1-1.2 l / h. Ang suspensyon ay hinalo para sa 1 h at centrifuged upang paghiwalayin ang precipitate ng nucleic acid para sa 1 h sa (9500±500) rpm, sa temperatura na (5±2)C. Pagkatapos ng centrifugation, ang supernatant ay pinaghiwalay, ang dami nito ay 3.0 l.

Sa mabagal na pagpapakilos gamit ang isang stirrer, 182 g ng dry ammonium sulfate ay ibinuhos sa supernatant sa maliliit na bahagi (bawat kasunod na bahagi ay idinagdag pagkatapos na ang nauna ay ganap na matunaw). Matapos makumpleto ang pagdaragdag ng ammonium sulfate, ipinagpatuloy ang pagpapakilos hanggang sa ganap na matunaw ang asin, at ang suspensyon ng protina na namuo ay pinananatili sa temperatura na (5 ± 2) C sa loob ng 16 na oras, at pagkatapos ay na-centrifuge ng 1 oras sa (13500 ±). 500) rpm sa temperatura na (5 ± 2) MULA.

Ang nagresultang precipitate ay natunaw sa distilled water, na dinadala ang kabuuang dami sa 4 na litro. Ang acid fractionation ng nagresultang solusyon na naglalaman ng alpha-2 interferon ay isinagawa upang mamuo ang mga kasamang protina. Upang gawin ito, 5.0 ml ng 50% acetic acid ay idinagdag sa solusyon sa pH 4.75. Ang nagresultang timpla ay inilipat sa isang refrigerator at iniwan sa isang temperatura ng (5±2) С para sa 3 h, pagkatapos ay ang suspensyon ng protina ay centrifuged sa (13500±500) rpm para sa 30 min sa (5±2)С.

Sa 4 l ng supernatant ay idinagdag ang 50.0 ml ng 1 M Tris solution sa pH (6.9 ± 0.1). Ang konsentrasyon ng kabuuang protina, na tinutukoy ng pamamaraang Lowry, ay 9.0 mg / ml, ang biological na aktibidad ng alpha-2 interferon (6.80.5) 106 IU / ml. Tukoy na aktibidad 8.5105 IU/mg. Ang kabuuang nilalaman ng alpha-2 interferon sa yugtong ito ay 2.91010 IU.

Ang Sorbent Soloz KG sa halagang 0.6 l sa anyo ng isang may tubig na suspensyon ay inilagay sa isang chromatographic column. Pagkatapos, gamit ang peristaltic pump, 2.0 L ng 0.2 M sodium hydroxide solution, 6.0 L ng distilled water, at 4.5 L ng 0.05 M Tris-acetate buffer solution ay sunud-sunod na dumaan sa sorbent sa pH (7.1 ± 0, 1), na kung saan ay sinusubaybayan gamit ang isang pH meter sa labasan ng haligi.

Ang solusyon ng protina na naglalaman ng alpha-2 interferon ay diluted na may distilled water sa isang conductivity ng (6.0+2.0) mS/cm sa temperatura ng kuwarto. Ang dami ng solusyon sa kasong ito ay 19.2 litro.

Ang solusyon ay inilapat sa haligi sa isang rate ng 1.5 l / oras, pagkatapos ay ang sorbent ay hugasan na may 2.0 l ng Tris-acetate buffer 0.05 M sa pH 7.0. Ang elution ay isinagawa gamit ang 1.2 l ng 0.05 M Tris solution na may pH (10.2±0.1) Ang nilalaman ng interferon sa mga fraction na nakolekta gamit ang fraction collector ay tinutukoy ng enzyme immunoassay.

Ang konsentrasyon ng kabuuang protina, na tinutukoy ng pamamaraang Lowry, ay (2.2 ± 0.2) mg / ml, ang biological na aktibidad ng alpha-2 interferon ay (2.1 ± 0.5) 107 IU / ml, ang tiyak na aktibidad ng gamot ay (9.7). ± 0.5)106 IU/mg. Ang kabuuang nilalaman ng alpha-2 interferon sa yugtong ito ay (1.5±0.5)1010 IU.

Ang Spherocell qae sorbent sa halagang 0.15 l sa anyo ng isang may tubig na suspensyon ay na-load sa haligi at hugasan sa isang rate ng 0.15 l / h sunud-sunod na may 0.5 l ng 2 M sodium chloride solution, 1.5 l ng distilled water at 1.0 l ng tris-acetate buffer solution na 0.05 M na may pH 8.0, na kinokontrol ang pH ng buffer solution sa labasan ng column na may pH meter.

Ang isang 0.7 l na solusyon sa protina na naglalaman ng alpha-2 interferon ay inilapat sa isang 0.15 l Spherocell-QAE sorbent column sa rate na 0.2 l/h. Ang haligi ay hugasan ng 0.05 M Tris-acetate buffer solution (pH 8.0) na may dami na 0.1 L, pagkatapos ay ang mga impurity protein ay hugasan ng 1.0 L ng parehong buffer solution na may pagdaragdag ng 0.05 M NaCI. Ang interferon ay na-eluted na may 0.8 l ng 0.1 M sodium acetate buffer solution sa pH 5.0. Ang nilalaman ng alpha-2 interferon sa mga fraction na nakolekta gamit ang isang kolektor ay tinutukoy ng enzyme immunoassay. Ang konsentrasyon ng protina ay (0.35±0.05) mg/ml, ang biological na aktibidad ng alpha-2 interferon ay (1.7±0.2) 107 IU/ml. Ang tiyak na aktibidad ng gamot ay 5.5107 IU/mg ng protina. Ang eluate ay naglalaman ng 1.20 x 1010 IU. Ang ani ng biological na aktibidad sa yugtong ito ay 82.5%.

Ang nagresultang solusyon ay nababagay sa pH (5.0 ± 0.1) na may 50% acetic acid at diluted na may 0.05 M sodium acetate buffer. Ang partikular na electrical conductivity ay (0.29±0.02) mS/cm sa temperatura na (5±2)C. Ang solusyon sa protina na inihanda sa ganitong paraan ay inilapat sa isang haligi na may Spherocell LP-M sorbent sa isang rate ng 0.1 l / h, hugasan ng 0.3 l ng buffer solution sa itaas, at pagkatapos ay ang interferon ay na-eluted gamit ang isang linear na sodium chloride na konsentrasyon. gradient na nilikha gamit ang isang Ultrograd gradient mixer. Ang eluate ay na-fractionate gamit ang isang fraction collector at sinukat ang konsentrasyon ng kabuuang protina at alpha-2 interferon. Konsentrasyon ng protina sa mga naka-pool na fraction (0.45±0.02) mg/ml. Ang dami ng solusyon ay 0.1 l. Ang kabuuang nilalaman ng alpha-2 interferon (8.6±0.2) 109 IU. Tukoy na aktibidad - e (7.5 ± 0.2) 107 IU / mg. Ang ani sa yugtong ito ay 73%.

Ang nagresultang 3 0.1 L na solusyon ay puro sa (5.0±0.2) ml na may ultrafiltration cell gamit ang isang Amicon YM-3 membrane. Ang sample na inihanda ay inilapat sa isang Sephadex G-100 sorbent column na equilibrated sa phosphate-buffered saline sa rate na 0.025 l/h. Ang dami ng mga fraction ay 10.0 ml. Ang mga fraction na nakuha pagkatapos ng chromatography ay nasubok para sa nilalaman ng alpha-2 interferon ng enzyme immunoassay at sa pamamagitan ng pagsasama-sama ng mga fraction na naglalaman ng pangunahing peak ng alpha-2 interferon. Ang dami ng nagresultang solusyon ay 30.2 ml. Ang konsentrasyon ng kabuuang protina, na tinutukoy ng pamamaraang Lowry, (0.90±0.02) mg/ml. Ang kabuuang nilalaman ng alpha-2 interferon sa solusyon ay 5.5109 IU. Ang tiyak na aktibidad ng nagresultang gamot na alpha-2 interferon 2.3108 IU/mg. Ang output ng alpha-2 interferon sa yugtong ito ay 90.2%. Ang nagresultang produkto ay isterilisado at nakabalot. Ang kabuuang ani ng gamot ay 35.8%, kabilang ang 51% sa yugto ng paglilinis.

Upang makakuha ng malaking halaga ng IFN, ginagamit ang anim na araw na single-layer na kultura ng mga cell ng chick embryo o mga kulturang leukocyte ng dugo ng tao na nahawaan ng isang partikular na uri ng virus. Sa madaling salita, upang makakuha ng IFN, isang partikular na virus-cell system ang nilikha.

Ang gene na responsable para sa biosynthesis ng IFN ay nahiwalay sa isang selula ng tao. Ang exogenous human IFN ay nakuha gamit ang recombinant DNA technology. Ang pamamaraan para sa paghihiwalay ng cDNA ng mga IFN ay ang mga sumusunod:

1) Ang mRNA ay nakahiwalay mula sa mga leukocytes ng tao, ito ay fractionated sa laki, ang reverse transcription ay isinasagawa, at ito ay ipinasok sa site ng binagong plasmid.

2) Ang resultang produkto ay binago sa E. coli; ang mga resultang clone ay nahahati sa mga grupo na natukoy.

3) Ang bawat pangkat ng mga clone ay na-hybrid sa IFN - mRNA.

4) Mula sa mga nagresultang hybrid na naglalaman ng cDNA at xRNA, ang mRNA ay nakahiwalay, ang pagsasalin nito ay isinasagawa sa sistema ng synthesis ng protina.

5) Tukuyin ang interferon antiviral na aktibidad ng bawat halo na nagreresulta mula sa pagsasalin. Ang mga pangkat na nagpakita ng aktibidad ng interferon ay naglalaman ng cDNA clone na na-hybrid sa IFN - mRNA; muling tukuyin ang isang clone na naglalaman ng full-length na IFN - human cDNA.

Katulad na impormasyon.